植物抗氧化肽制备和活性研究方法*

叶 勇，周春卡，唐小月，黄传庆，张 悦

(华南理工大学化学与化工学院制药工程系，广东 广州 510640)

生物活性肽是一种特殊的蛋白质片段，对生命健康以及生理功能有显著影响，其中抗氧化肽是一种最重要的生物活性肽。它分为天然抗氧化肽、蛋白降解抗氧化肽和人工合成抗氧化肽三种，以蛋白降解多肽为主，从动植物中提取蛋白得到，主要存在于大豆、核桃、鹿茸、麦胚、鹰嘴豆、桑叶、大米、玉米、坚果、菜籽等植物种子中。酶解植物蛋白制备抗氧化肽无污染、条件温和、安全性高、专属性强、易于控制，因而倍受青睐[1]。本文对其酶法制备、分离、纯化、测定方法和应用进行归纳，以发掘存在的问题和解决策略。

1 前处理和酶解

植物蛋白可通过酶解法分级提取蛋白多肽，此法需要根据实际情况进行一些酶解前处理，如热处理、超声波处理、高压处理、微波处理等[2]。通过热处理可以改变蛋白质构象，一定程度上破坏蛋白质的二级结构，使酶切位点更易于与酶接触，提高酶解效率。通过超声波处理的机械作用和空化作用对蛋白质的水解具有显著影响，提高酶与酶切位点的结合几率，增加疏水基氨基酸的含量，以此提升抗氧化肽的抗氧化能力，但是过低的超声功率达不到预期效果，过高的功率会破坏酶的活性，所以要谨慎控制使用条件。通过高压处理可以改变蛋白质氨基酸侧链间的疏水作用，进而破坏蛋白质的三级结构，还可以破坏各个亚基间的三维空间分布，进而破坏四级结构，但是对部分球状蛋白质的二级结构影响不大。超高压会使蛋白质结构变得松散，更容易被酶水解。通过微波处理可以缩短蛋白质的水解时间，提高反应效率。

酶解法一般采用一种或多种蛋白酶。在酶解过程中，酶种类和酶解条件的不同都将影响到水解效果、蛋白回收率和多肽的氨基酸序列，最终影响水解物的抗氧化活性。因此，大部分酶解实验都会采取单因素分析，例如先固定酶解温度、初始pH值和水解时间等，用不同蛋白酶水解目标蛋白，通过比较各产物的水解度和生物活性，以此来选择最适合的酶，而后经过多因素考察达到优化酶解条件的目的。蛋白酶种类、温度、pH值、酶解时间和酶添加量都是重要因素。表1列出主要蛋白酶的水解制备抗氧化肽的作用，可见不同酶处理得到不同大小的多肽，但其功效主要取决于底物蛋白来源。

表1 蛋白酶水解制备抗氧化肽的性能

2 分离和纯化

抗氧化肽的分离纯化方法主要有大孔吸附树脂技术、膜分离技术、色谱法分离技术以及毛细管电泳法等。表2列举了抗氧化肽的分离纯化实例。大孔树脂和膜技术可以进行粗分离，而结合凝胶柱色谱、HPLC或毛细管电泳等方法可以实现精分离，得到纯化的多肽。

表2 抗氧化肽分离纯化方法

3 结构鉴定

抗氧化肽分子量的分布测定方法有超滤分级、高效液相色谱法以及SDS-PAGE电泳法等。不同分子量多肽的氨基酸组成不同，其抗氧化活性也不同。

抗氧化肽的一级结构，可以运用2级质谱鉴定方法进行探索。表3列举了一些食源性抗氧化肽的氨基酸序列。

蛋白质二级结构的测定经常使用的方法是傅里叶红外光谱。各峰与二级结构的对应关系为：(1610～1640) cm-1为β-折叠，(1640～1650) cm-1为无规则卷曲，(1650～1660) cm-1为α-螺旋，(1660～1700) cm-1为β-转角。由于对蛋白质二级结构以及宏观功能性质研究不足，仅靠红外光谱完全解释二级结构的构效关系有一定的局限性。

表3 抗氧化肽的氨基酸序列

4 活性测定

抗氧化肽主要通过两种方式产生作用，一是通过淬灭自由基；二是通过其他途径来进行抗氧化反应。根据其抗氧化机制，测定抗氧化性能的方法主要分为以下三类：基于自由基清除能力的测定方法，基于抑制脂类物质氧化能力的测定方法以及基于螯合金属离子的测定方法。

由于自由基种类不同，基于自由基清除能力的抗氧化活性测定方法可分为：DPPH法、ABTS法、羟自由基法、超氧阴离子法、ORAC法、TRAP法和ESR法。

基于抑制脂类物质氧化能力通常有如下三种方法：(1)铁硫氰酸法，利用脂质过氧化物把亚铁离子氧化成铁离子，然后与硫氰酸铵反应，产物在500 nm处有强吸收。(2)硫代巴比妥酸法，利用脂质氧化生成的丙二醛与硫代巴比妥酸反应生成物在532～535 nm有最大吸收峰来测定。(3)亚油酸残余值，通过HPLC/GC测定。

基于螯合金属离子的测定方法，是由于Fe2+等金属离子可以加速自由基的生成，进而发生氧化还原反应。通过检验不同分子量带的蛋白质螯合金属离子能力的不同来测定抗氧化性能。

由于蛋白质水解物很复杂，单一使用某种方法测定抗氧化性难以得到可信度高的结果，所以联用方法更有利于测得可信结果。

5 构效关系

影响抗氧化肽活性的因素有多种，如氨基酸种类、相对分子质量、一级结构和空间结构等。

(1)氨基酸种类：抗氧化肽的N端，多为疏水性氨基酸，其脂肪族烃侧链更利于抗氧化肽的反应发生，使得抗氧化肽的转移快速，机体产生的活性氧容易与抗氧化肽结合进而进行活性氧清除反应。对于抗氧化三肽来说，其N端的氨基酸是疏水氨基酸会增加其抗氧化活性。芳香族氨基酸可以使抗氧化肽更加稳定，因存在共轭体系而维持自身稳定。

(2)相对分子质量：植物蛋白抗氧化肽的相对分子质量对自身的抗氧化性能有显著影响，一般来说，相对分子质量较低的肽链其抗氧化性能越强，小分子更易于通过体内的各种屏障从而实现药理功能，相对分子质量高的蛋白往往会由于自身的三级结构使得活性位点被包裹住，难以接触底物，不能最大限度的发挥作用。

(3)一级结构：许多氨基酸独立存在时并没有表现出抗氧化活性，但是某些氨基酸按一定的方式排列组合后却具有良好的抗氧化性能。组氨酸在抗氧化肽的位置和构象对肽链的抗氧化性能有很大影响；另外肽的序列、肽键本身以及肽的构象对抗氧化活性都有不同程度的影响；一些特殊结构的组合对肽的抗氧化功能而言也具有特殊意义，如谷氨酸和亮氨酸组合在肽链中会使其显示抗氧化性能。

(4)空间结构：活性肽的生物活性一般都与其空间构象有关。但是由于目前对空间构象与功能的关系研究不够透彻，所以抗氧化肽在不同条件下的抗氧化活性与其空间构象的关系，值得探究。

提升抗氧化性的途径有两种：一种是运用单因素和多因素试验来探索最优酶和最适酶解条件；第二种是利用分子操作，插入特定的氨基酸，以获得期待的氨基酸序列，进而提高抗氧化肽的抗氧化性能和自身结构存在的稳定性。

6 应 用

大多数代谢性的疾病的产生都与体内的氧化产物有关，氧化应激可以破坏细胞和线粒体的结构，影响人体正常的生理功能。多肽类药物是近年来的新药研发热点，作为有效的活性氧清除剂，抗氧化肽在抗衰老、抗心脑血管疾病和抗肿瘤等领域具有广阔的应用前景。

在化妆品领域，抗衰老日渐成为一大热点，其中天然成分的研究更是如火如荼，生物多肽满足了人们的需求，抗氧化肽的化妆产业应运而生。自由基的清除能有效对抗由于过度氧化引起的皮肤衰老问题，可见，抗氧化肽在化妆产业的发展前景广阔。

在饲料中，由于多肽制品不仅本身具有丰富的营养价值，而且对动物的疾病起预防作用。多肽可以促进蛋白质的合成，促进系统对矿物质的吸收，提高生物体的免疫性能。但是饲料应用中的抗氧化肽一般不是单一的肽，而是混合多肽，所以会不同程度的存在致敏性，有一定安全隐患，需要针对性地开发单一多肽。

虽然，国内外对抗氧化肽的研究已有数十年，但是到目前只有少数的产品可以用于工业生产和商业化，因为需要解决构效关系的研究难题，并要进行临床试验来检测产品的各种活性以及安全性。

7 结 语

随着人们对于抗氧化肽越来越多的关注研究，抗氧化肽的制备、分离纯化、结构鉴定、构效关系和抗氧化性能等的研究也日渐深入。选取不同底物蛋白，然后根据实际情况进行酶解前处理，用单因素实验和多因素试验找到最适的酶解条件和最优酶，得到酶解产物后，选取合适的方法，可以联用各种方法进行分离纯化，获得更强功效的多肽，并可探究蛋白分子量、氨基酸组成、一级结构、二级结构等，分析构效关系来研究不同的抗氧化机制，为后续的临床试验提供科学的数据，进而推进工业生产和商业化应用。