一株蓝莓溃疡病拮抗菌发酵条件优化及稳定性研究

丁芮涵，侯丽伟，刘庆珍，毛 赫，于海媛，张晓光，李立梅

(吉林省林业科学研究院，吉林 长春 130033)

蓝莓，又名越橘，是杜鹃花科(Ericaceae)多年生灌木果树，其营养价值丰富，素有“水果之王”的美誉，食用后可增加机体免疫力，具有医疗保健作用[1]。

迄今国内已有27个省(市)有蓝莓种植地，分为四大产区：胶东半岛产区、长白山产区、云贵高原产区和长江中下游产区。截至2017年，我国蓝莓种植面积已经从2001年24 hm2增长到2 049 hm2。

随着蓝莓种植面积的加大，蓝莓病害日趋严重，给蓝莓生产造成的经济损失惨重[2]。蓝莓病害中危害性最强、最难防控的属蓝莓溃疡病，其病原菌为葡萄座腔孢菌(Botryosphaeriadothidea)。目前，研究多集中在蓝莓溃疡病的病原学鉴定方面[3]。康海婷等人对抗蓝莓溃疡病的蓝莓品种进行了筛选研究[4]。针对该病害的防治多集中于化学防治，而针对蓝莓溃疡病抗生素的报道较少。

本研究获得的拮抗菌株CX3具有杀真菌活性组分，分析认为，是由于拮抗菌CX3在发酵过程中的次级代谢产物发挥作用[5]。在菌种发酵的进程里，想要菌种发酵的效果好，需要准确摸索出其发酵的最佳条件和培养基配方[6]。

本研究筛选获得1株对蓝莓溃疡病菌有很好抑制效果的菌株(CX3)，其发酵液对蓝莓溃疡病菌有极强的抑制作用，经测定，其对多种农林重要病害、病原菌有较好的抑制作用，广谱性好，开发潜力极大[7]。为了更好地发挥CX3的抑菌效果，作者对CX3的发酵条件进行优化，以期为蓝莓溃疡病的生物防治奠定理论基础并提供技术参考。

1 试验材料

供试菌株：菌株CX3(Streptomycessp.)：由吉林省林业科学研究院分离保存并鉴定。靶标菌为蓝莓溃疡病菌(Botryosphaeriadothidea)，由延安大学徐成楠副教授馈赠。

原始发酵培养基：可溶性淀粉70 g、花生饼粉33 g、(NH4)2SO44 g、NaCl 4 g、CaCO34 g、蒸馏水1 000 mL、pH7.0。

1.1 发酵条件优化

1.1.1 培养基营养条件优化

供试碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉，对照组不添加碳源。

供试氮源：玉米粉、大豆粉、牛肉膏、麦麸、尿素、花生饼粉，对照组不添加氮源。

供试无机氮源：以KNO3、NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4，对照组不添加无机氮源。

原始发酵条件为：种子液与培养基体积比为3 %，pH7.0，28 ℃，150 r·min-1恒温摇床培养5 d。发酵完成后收集发酵液，6 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，收集上清液，采用杯碟法测定发酵液抑菌活性。每组处理3次重复。

1.1.2 发酵培养基正交设计优化

根据以下方案制成培养基，进行发酵试验(表1)。使用正交优化法对培养基配方进行优化，选择抑菌直径最大的组分作为培养基配方，每组试验重复3次。

表1 营养成分体积分数水平

1.1.3发酵条件优化

采用单因素分析法。在原始发酵培养基的基础上，分别改变发酵时间、pH、种龄、发酵温度、摇床转速和种子液与培养基体积比(表2)。发酵完成后，将发酵液置10 000 r·min-1、4 ℃离心处理10 min后取上清液，采用杯碟法测定发酵液抑菌活性，每组试验重复3次。

表2 发酵条件水平

1.2 发酵液理化性质测定

选用优化后的发酵培养基配方与发酵条件，进行发酵。收集离心后的发酵上清液，对发酵液的pH稳定性、热稳定性、光稳定性、耐贮性进行测定。

1.2.1 pH稳定性测定

将收集到的发酵上清液分成14组，分别用浓度为1 mol·L-1盐酸和1 mol·L-1氢氧化钠溶液将发酵液的pH调节为1～14，室温放置24 h，然后将所有处理pH调至7。以杯碟法测定抑菌活性，每组试验重复3次。

1.2.2 热稳定性测定

分别设置两组试验进行热稳定性测定。

第一组：将发酵液置于不同温度的水浴锅内，30 min后取出，待冷却至室温后检测抑菌活性。温度设置：30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃、121 ℃。

第二组：将发酵液置于100 ℃水浴锅内加热不同时间后取出，待冷却至室温后检测抑菌活性。时间设置：10 min、30 min、60 min、120 min。

以上试验均重复3次。

1.2.3光稳定性测定

取发酵上清液，于紫外光和自然光下照射不同时间后，以未经光照处理的发酵液为对照，分别测定抑菌活性。每个试验重复3次。

1.2.4 耐贮性测定

取适量发酵液分别置于-20 ℃、4 ℃、室温放置15 d，对照组为未经搁置的新鲜发酵液，分别测定抑菌活性。每个试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 发酵条件优化

2.1.1 培养基营养条件优化

拮抗菌CX3发酵的最佳营养条件结果显示如下(图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12)。

图1 不同碳源对菌株发酵液抑菌效果的影响

图2 不同碳源发酵液的抑菌圈

图3 不同有机氮源对菌株发酵液抑菌效果的影响

图4 不同有机氮源发酵液的抑菌圈

图5 不同无机氮源对菌株发酵液抑菌效果的影响

图6 不同无机氮源发酵液的抑菌圈

图7 不同碳源体积分数对菌株发酵液抑菌效果的影响

图8 不同体积分数碳源发酵液的抑菌圈

图9 不同有机氮源体积分数对菌株发酵液抑菌效果的影响

图10 不同体积分数有机氮源发酵液的抑菌圈

图11 不同无机氮源体积分数对菌株发酵液抑菌效果的影响

图12 不同体积分数无机氮源发酵液的抑菌圈

所有供试碳源均能被菌株CX3所利用。其中，葡萄糖的发酵液抑菌效果最好，抑菌直径达22.3 mm。

供试有机氮源中尿素不能被菌株CX3所利用，花生饼粉作为有机氮源的发酵液抑菌效果最佳，抑菌直径达20.79 mm。

所有供试无机氮源均能被菌株CX3所利用，其中硝酸钾的发酵液抑菌效果最好，抑菌直径达28.7 mm。

2.1.2 发酵培养基正交设计优化

确定了最佳碳源、有机氮源和无机氮源的成分和最适体积分数范围后，对最佳碳氮比进行优化，试验设计如表3。优化前后对比见图13。

表3 发酵培养基正交设计水平因素

数据经聚类分析正交软件处理结果如表4所示，可知A(葡萄糖)、B(花生饼粉)、C(硝酸钾)三个因素中，对发酵液抑菌效果影响的主次顺序为：B>C>A。

由此可以得到发酵培养基最佳碳氮配比为：葡萄糖6 %，花生饼粉4 %，硝酸钾0.4 %。优化前的抑菌直径是15.93 mm，优化后是24.88 mm，抑菌效果有明显提升。

表4 发酵培养基正交试验结果

图13 优化前后对比

2.1.3 发酵条件优化

发酵条件优化试验结果如图14所示，初始pH的不同会对菌种的发酵有较大影响。pH为3时，发酵液的抑菌效果较弱，与其他处理组差异显著；发酵时间3～6 d内，发酵液抑菌活性随时间的增加而增强，发酵6 d后抑菌活性不再增强；选取种龄6 d、7 d的种子液发酵后，抑菌效果最好。考虑节约时间与成本，选取种龄为6 d的种子液，种子液与培养基体积比为5 %时的发酵液抑菌效果最好，故最适发酵条件为：发酵温度28 ℃，pH 7.0，发酵时间6 d，摇床转速150 r·min-1，种龄6 d，种子液与培养基体积比5 %。

图14 不同发酵条件对菌株CX3抑菌效果的影响

2.2 发酵液理化性质测定

CX3发酵液的理化性质测定试验结果如图15所示。发酵液对酸性环境敏感，对碱性环境耐受性好，在pH3～14之间均表现出很好的抑菌效果。热稳定较好，发酵液在经过100 ℃处理后，随着处理时间的增加，抑菌效果逐渐减弱；随着处理温度的增加，发酵液抑菌效果逐渐减弱，121 ℃处理时丧失抑菌活性。耐贮性试验表明，CX3发酵液耐贮性极强，常温下也可长效保持抑菌活性。光稳定性极强，在自然光和紫外光照下均表现出极强的抑菌效果。

注：A为pH稳定性；B为热稳定性，100 ℃处理不同时间；C为热稳定性，不同温度处理30 min；D为耐贮性；E为自然光照稳定性；F为紫外光照稳定性。

3 讨论

3.1 发酵环境条件优化

研究表明，菌株CX3的发酵与其自身属性、培养基的配方和发酵时的环境密切相关，只有应用条件在发酵条件都达到合适的程度才能有效提高发酵产出次级代谢产物的效率。在大型发酵设备的生产工艺研究中，发酵条件还需严格把控通气量等因素。

3.2 培养基正交设计优化

碳源和氮源作为培养基中重要组成成分，可为菌体的生长发育提供必要的营养和能量，并且在菌体代谢过程中起到重要作用[8]，在发酵过程中，碳源和氮源的含量会直接影响发酵效果。碳氮源不足时，会不利于次级代谢产物的合成；碳源过多的培养基会使菌种发生自溶；氮源过多会造成菌体生长过量而次级代谢产物积累较少。因此，合理的配比对菌体的发酵至关重要。

3.3 发酵条件优化

适宜的pH能够使菌体的代谢更加顺畅，同理，不利的pH会使菌体代谢发生受阻[9]。同时，在发酵过程中还需要摸索好菌株的对数生长期[10]，选取对数生长期的菌液作为种子液，以更好的促进菌种发酵，从而达到次级代谢产物高产的目的[11]。

4 结论

菌株CX3的发酵培养基优化后的最佳配方为：葡萄糖60 g，花生饼粉40 g，硝酸钾4 g，氯化钠4 g，碳酸钙4 g，水1 000 mL，pH 7.0。最佳发酵条件为：发酵温度为28 ℃，摇床转速150 r·min-1，初始pH7，发酵时间6 d、菌株种龄6 d、种子液与培养基体积比5 %。优化前的抑菌直径是15.93 mm，优化后是24.88 mm。发酵液理化性质测定结果：发酵液耐碱不耐酸；对温度的耐受性好，但长时间暴露于高温下会使发酵液失活；耐贮性好，常温保存的发酵液也可保持抑菌活性。

CX3的发酵与其自身属性、培养基的配方和发酵时的环境关系密切，因此，找寻出CX3发酵液的最佳营养条件和发酵条件，从而获得高产的次级代谢产物的研究十分有意义。本研究从多个方面对链霉菌CX3的发酵条件进行优化，并对其次级代谢产物的理化性质进行测定，结果表明，CX3极具开发潜力，有望投入到大规模发酵设备中量化生产，其发酵获得的次级代谢产物能够作为生防菌剂防治蓝莓溃疡病，为浆果病害防治提供新的方法。