男性不育患者精子DFI与其他精液参数的关系*

冯 玲，乔 静，冼英杰，颜秋霞，周秀琴，陈润强，张国志，陈彩蓉

广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院生殖中心，广东清远 511518

近年来，不孕不育的夫妇逐年增多，大多数不孕不育夫妇需要通过辅助生殖技术(ART)来实现生殖愿望，患者双方经济与精神压力增加，并可能影响家庭和睦[1]。有研究显示，在中国约有1 250万个不孕不育的家庭，其中约40%是由男性因素造成的[2]。目前，诊断男性不育的方法主要为精液量、精子浓度、精子存活率、精子活动力和精子形态等实验室指标检测，然而这些参数可能会受实验员的主观判断影响，且波动范围较大，仅靠这些参数评估男性生育力已不能满足临床需要[3-4]。根据相关研究统计，大约有15%不育男性的精液常规检测结果是正常的[5]。因此，临床上需要寻找更客观、更准确、更稳定的检测指标对精液质量进行评估。精子DNA碎片指数(DFI) 检测时受外界影响较少，而且可以从精子的染色质层面评估精子质量[6]。精子DFI不仅有助于探索男性不育和女性自然流产的病因，还有助于更好地评估男性的生育力，对预测辅助生育的结局具有重要作用[7]。

1 资料与方法

1.1一般资料 对2019年1月至2020年1月于本院生殖中心进行了精液常规检测、精子形态学分析及精子DFI检测的959例男性不育患者的检测结果进行回顾性分析，患者年龄为22～59岁，平均(34.3±6.2)岁。纳入标准：(1) 婚后不采用避孕措施，正常性生活，1年以上不育；(2)无遗传性疾病或性功能障碍病史；(3) 体格检查未发现阴茎、附睾、睾丸、输精管等有异常。排除标准：(1)生殖系统发育异常；(2)取精时精液射于杯外，有遗漏；(3)无精子症；(4)女方因素导致未怀孕。

1.2方法

1.2.1精液常规检测及形态学分析 嘱咐患者取精前禁欲2～7 d，精液标本采集必须完整，使用本中心提供的清洁、无毒的专用取精杯，通过手淫的方式收集一次射精的全部精液于杯内，及时放入37 ℃恒温水浴箱。待液化后，精液标本参照《WHO人类精液检查与处理实验室手册(第五版)》的标准进行处理，用西班牙SCA精液分析仪做精液常规分析。精液标本制片干燥后，先用Diff-quik染色法快速染色、晾干，在显微镜的油镜下镜检，借助实验室计数器，评估200个没有重叠的完整精子，对每个精子的各部位仔细观察，严格区分正常与缺陷的精子。正常形态精子百分率=正常精子数/200×100%，正常参考值为≥4%。

1.2.2精子DFI检测 采用精子染色质扩散试验(SCD)进行检测，精子核DNA完整性的检测试剂盒(生产许可证编号：粤食药监械生产许20030802号)为深圳华康生物医学工程有限公司的产品。实验操作步骤严格按照试剂盒说明书实施，精液经过酸化变性处理，去除核蛋白，保留精子DNA部分。封片染色后，在高倍显微镜下对400个精子进行精确观察、判断后再计数。通常，DNA比较完整的精子在其头部四周能看到因精子染色质环附着于残留的精子核而扩散形成特征性大晕环或中晕环；而精子核DNA损伤较大的精子，头部周围仅见少量的晕环，有些甚至看不到晕环。根据精子是否出现晕环，以及晕环大小判断该精子DNA是否完整，碎片率有多少。精子DFI=(无晕环精子+小晕环精子+退化精子)/400×100%，正常参考值<30%。根据精子DFI的检测结果进行分组，Ⅰ组精子DFI<30%，Ⅱ组精子DFI≥30%。

2 结 果

2.1分组情况、精液常规检测及精子形态学分析结果 根据精子DFI的检测结果进行分组，Ⅰ组精子DFI<30%，有754例；Ⅱ组精子DFI≥30%，有205例。Ⅰ组的精子存活率、前向运动精子百分率(PR)、非前向运动精子百分率(NP)和正常形态精子百分率明显高于Ⅱ组，差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ组的年龄、不动精子百分率(IM)明显低于Ⅱ组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 Ⅰ组和Ⅱ组的精液常规检测及精子形态学分析结果比较

2.2精子DFI与精液常规检测及精子形态学分析结果的相关分析 精子DFI与精子存活率、PR、NP和正常形态精子百分率呈负相关(P<0.05)，而与患者年龄和IM呈正相关(P<0.05)。见表2。

表2 精子DFI与精液常规检测及精子形态学分析结果的相关分析

3 讨 论

众所周知，DNA是实现遗传信息传递的重要载体，父系遗传物质要正确传递给子体必须通过完整的精子DNA序列来实现信息交换，精子异常的染色结构会影响精卵结合、受精卵分裂及胚胎正常发育[8]，且可能导致复发性流产。有研究发现，精子核DNA产生损伤主要是由该患者体内精子出现氧化应激，引起精子染色质无法进行正常组装，以及精子出现难以预测的异常凋亡等[9]。精子 DNA 常见的损伤形式一般有以下几种：(1)DNA出现碎片；(2)一些形态异常的染色质难以实现包装；(3)精子体内鱼精蛋白不足或严重缺乏。而精子DNA出现碎片是最常见、最主要的DNA损伤形式[10]。MOSKOVTSEV等[11]研究发现，当精子DFI≥30%时，男性生育力下降。因此，本研究按照精子DFI值<30%与≥30%分组。

近年来，随着医学技术的快速发展，我国学者对精子DNA完整性与反复流产的关系做了大量的研究，发现复发性流产与精子DFI密切相关，精子DNA碎片可能会导致胚胎无法正常发育，使流产率增加[12-14]。ZHANG等[15]的研究发现，在实施ART时，高精子DFI可能会对受精、胚胎发育等产生不良影响。辜秀丽等[16]相关研究认为，不育男性的精子DFI会随着年龄的增加而明显升高，本研究结果也验证了这一观点。原因在于随着年龄增长，生殖器官老化，导致自由基增加、生精过程中的抗氧化作用及精子DNA修复能力下降，也意味着精子细胞膜无法受到保护，免受攻击，从而导致精子DNA受损。本研究结果还显示，精子DFI与PR、NP呈负相关，提示男性不育患者的精子可能存在着较多的DNA碎片，精子损伤较严重。ASHOK等[17]研究发现，精子 DNA损伤可能影响精子内呼吸链，使精子运动供能异常，进而使精子活力减弱，与本研究结果一致。此外，在本研究中，还发现精子DFI与正常形态精子百分率呈负相关，这表明精子DNA损伤会破坏精子的正常形态结构，使畸形精子增多，这与AYDOS等[18]的观点相符。因此，精子DFI在一定程度上可以预测患者精子存活率和形态等情况，临床查找患者不育原因时最好同时进行精液常规检测、形态学分析及精子DFI检测。

综上所述，精子DNA损伤可能会使精子活力下降、异常形态精子增多，也可能间接导致无法正常受精、胚胎停止发育、流产等。精子DFI能较全面、客观地评估精子质量，为生殖医学临床诊断与治疗男性不育提供新的方法和方向。在今后的研究中，将深入研究复发性流产患者其配偶精子 DNA 损伤是否对行ART后的胚胎发育产生影响，进一步探讨精子DFI 在男性不育中的临床应用价值，希望能改善接受ART治疗患者的妊娠结局。