低剂量CT灌注联合影像组学评估非小细胞肺癌的纵隔淋巴转移

孙国臣，王明甫

国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)2012年统计数据显示肺癌是目前全球发病率以及死亡率最高的肿瘤之一，平均每年死亡人数达160万[1]，到2015年，全球共计1750万癌症病例，870万死亡，其中肺癌死亡人数高达120万人[2]。肺癌包括小细胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)，根据肺癌流行病学调查显示，NSCLC占肺癌发病的85%[3]。2020年中国临床肿瘤学会(CSCO)非小细胞肺癌诊疗指南第八版最新肺癌TNM分期，将是否出现淋巴转移分为N0期、N1-3期。该诊疗指南明确提出对于不同病例类型、分期和分子分型(包括不同驱动基因)的NSCLC，临床提示不同治疗方案。因此临床上针对N0-1期以及N2-3期的NSCLC则采用不同的治疗方案[4]。由于N1期患者与N2-3期患者均出现淋巴转移，然而N1期属非纵隔淋巴转移，N2-3期属于纵隔淋巴结转移(mediastinal lymph node metastasis，MLNM)。NSCLC患者接受外科手术时，往往需要接受淋巴清扫，目前外科手术中常见淋巴清扫方式包括纵隔淋巴结、隆突下淋巴结等区域定点清扫或非选择性清扫，美国癌症联合委员会关于肺癌的第八版肺癌分期中提出不同淋巴结站点的清扫对患者的预后有影响[5]。因此对于NSCLC有效评估纵隔淋巴转移有助于协助NSCLC外科手术中淋巴结定点清扫的区域评估以及手术预后的收益评估，同时针对高手术风险NSCLC患者而言，非手术途径评估纵隔淋巴转移有助于临床医生针对患者制定个体化治疗方案。

目前，除手术取样活检是纵隔淋巴是否转移的金标准，纵隔镜取样活检也可用于判断淋巴是否转移[6],纵隔镜取样具有侵袭性且易诱发手术并发症[7-8]。因此，非侵袭性评估纵隔淋巴转移方法的建立具有重要临床价值。PET/CT可非侵袭性评估MLNM，然而PET/CT费用昂贵，且检查完毕后一定时长内，患者体内的造影药物带有放射性[7,9]。CT常规用于NSCLC的诊断，可提示临床考虑是否有淋巴结转移，无法确定是否MLNM[10-11],且CT信号值只与成像范围中受试患者的组织密度大小相关，缺乏特异性。低剂量CT灌注可通过CT对比剂定量反映血管参数：血流量(blood flow，BF)、血容量(blood volume，BV)、平均通过时间(mean transit time，MTT)、血管通透性(permeability，PMB)，可反映肿瘤的血管生成，因此可尝试用于评估淋巴结转移[12-13]，同时相对于常规CT灌注，低剂量CT灌注可减少辐射。影像组学基于影像提取海量特征，2012至今广泛尝试于临床上构建影像定量模型评估肿瘤异质性，其准确性和可重复性目前不断提升[14-16]。本研究基于低剂量CT灌注图像提取灌注参数以及影像组学特征，联合病理检测等特征构建联合模型评估NSCLC纵隔淋巴转移的风险。

材料与方法

1.病例资料

本研究获取南阳市第一人民医院以及湖北省第三人民医院伦理委员会批准，所有入组患者需在充分了解该项研究方案的安全性以及潜在风险性后，签署知情同意书。搜集2018年3月-2020年5月南阳市第一人民医院经病理证实为NSLC的住院患者，并按照以下标准进行筛选：①入组患者需为本院首诊患者；②需在术前1～2周内进行CT灌注扫描，且CT灌注前未接受过任何治疗；③患者无CT对比剂禁忌史；④无严重的心、肺或肾功能不全。

2.低剂量CT扫描方案

所有患者均行低剂量CT灌注扫描，扫描设备为Siemens SOMATOM Definition Flash双源800排CT。CT扫描方案分为CT平扫以及CT动态增强扫描。患者仰卧，双手上举过头顶，首先行CT平扫，扫描参数如下：100 kV，100 mAs，矩阵512×512，层厚8 mm。CT平扫后，技师根据CT平扫图像确定CT灌注扫描的范围，CT灌注扫描范围为患者屏气时，分别超过肿瘤上下边缘的3.5 cm。扫描开始时，患者经肘静脉高压团注对比剂(Visipaque， 270 mg I/mL，通用电气药业上海有限公司)50 mL，注射流率6.0 mL/s，注射2～5 s后行灌注动态扫描，扫描参数：80 kV，120 mAs，重建层厚3 mm，重建层间距2 mm。

3.图像后处理

将肺癌患者的CT灌注图像导入至后处理工作站(Siemens Syngo Multimodality workplace,Siemens， GERMAN)。本科室具有5～10年诊断经验的诊断医师对图像进行后续处理。图像导入工作站后，选择VPCT(volume perfusion computed tomography)后处理功能。首先勾选胸主动脉为动脉输入函数(artery input function,AIF)，然后由诊断医师选择肿瘤最大病灶层面进行兴趣区(region of interest，ROI)勾画。ROI勾画时需注意：①进行ROI勾画的层面不得有影响病灶判断的运动伪影；②勾画ROI外缘时需离肿瘤边界2～3 mm；③应避免勾选坏死、钙化以及血管区域；③诊断医师采取单盲原则进行图像勾画。勾画完毕后，提取CT灌注参数BF、BV、MTT和PMB。CT灌注参数提取完毕后，由本研究两位诊断医师将CT灌注图像导入ITK-SNAP (www.itksnap.org)进行ROI勾画。勾画的ROI面积与CT灌注参数提取的ROI相同。将该ROI与CT灌注图像导入AnalysisKit(Version V3.0.0.A, GE Healthcare,China)提取海量影像组学参数。

4.病理检测

术中需清扫的淋巴结包括N1以及N2站，其中病灶于左侧患者左侧的4、5、6、7、9组纵隔淋巴结，病灶位于右侧的患者则需要清除右侧2、4、7、9组纵隔淋巴结，并于术后进行病理学检测判断是否存在淋巴转移情况。术中取患者肿瘤组织至4%多聚甲醛中固定，并采用石蜡包埋，切5 μm切片。取患者石蜡切片进行脱蜡处理，接着滴加100～200 μL 3% H2O2孵片10 min，将切片置于洗缸中加入PBS振荡洗片3次，每次5 min。按照1:100比例稀释CD34一抗(MA5-32833,ThermoFisher)。滴加150～200 μL一抗稀释液室温孵化1 h。重复洗片3次，每次5 min，随后滴加一抗增强液，室温孵化30 min，重复洗片3次，每次5 min。滴加二抗，室温孵片15 min，重复洗片3次，每次5 min，最后滴加DAB显色，根据光镜判断染色效果，最终染色细胞核，封片。封片完毕后，将切片放置于光镜下观察，分别以40倍、100倍物镜进行采图。微血管密度(microvascular density，MVD)计数方法：首先每个患者切片于40倍下随机选择6个区域，每个区域换至100倍物镜下进行微血管计数，视野下呈阳性染色的内皮细胞或细胞团，同时与周围肿瘤细胞或其他组织可区分，即使未形成血管管腔，仍计入微血管数目，统计6个区域的微血管数，最终取平均值即为MVD。

5.统计分析

本组研究采用R studio软件进行处理分析，并采用“xml2”、“tidyverse”、“caret”、“pROC”、“glmnet”、“DMwR”、“rmda”、“ggpubr”、“ModelGood”、“rms”、“mRMRe”、“DescTools”、“Publish”数据包。采用Kologoroy Smirnov检验计量资料是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料用平均值±标准差表示，不符合正态分布的计量资料用中位数表示。计数资料采用χ2检验进行比较，计量资料采用独立样本t检验或Mann-WhitneyU检验进行比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。基于受试者操作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线下面积(area under curve，AUC)评估评分系统效能。采用Graphpad Prism 8 software(Graphpad，USA)以及MedCalc software (Version15.2.2,www.medcalc.org)进行图形优化。

结 果

1.入组病患临床资料以及CT灌注参数结果

本研究共计纳入57例患者，其中31例经病理结果证实为纵隔淋巴转移(以下简称淋巴转移)，26例为非淋巴转移。淋巴转移患者中女性13人，男性18人；非淋巴转移患者中女性11人，男性15人，差异无统计学意义(P=0.98，表1)。淋巴转移患者的平均年龄为(52.3±4.7)岁，非淋巴转移患者的平均年龄为(51.8±4.4)岁。淋巴转移患者中58%(n=18)吸烟，非淋巴转移患者中39%(n=11)吸烟，差异无统计学意义(P=0.24，表1)；淋巴转移患者MVD略高于非淋巴转移患者，但差异无统计学意义(52.0±9.2 vs 52.0±9.2，P=0.24，表1)；淋巴转移患者BV低于非淋巴转移患者，且差异具有统计学意义(9.4±1.7 vs 10.3±1.4，P=0.04，表1); 淋巴转移患者MTT以及PMB均略高于非淋巴转移患者，但差异无统计学意义(P=0.23 vsP=0.33，表1)。

图1 最小绝对收缩与选择算子算法逻辑回归模型构建影像组学标签。a)x轴表示惩罚系数取值，y轴表示二项式偏差值，当选择图中虚线所对应的惩罚系数值λ时，此时对应的二项式偏差值最小，对应的x轴向上为6个特征系数，此时λ为最佳惩罚系数值；b)当对应取6个特征系数时，显示此时的惩罚系数值logλ=0.087，曲线则为不同自变量在LASSO模型中随着惩罚系数的改变所对应的系数改变曲线，虚线为10倍交叉验证后对应的logλ=0.087。

图2 影像组学标签Radscore构建特征参数系数以及训练组验证组中淋巴转移和非淋巴转移患者的差异。a)构建影像组学标签Radscore的6个特征参数的权重系数值；b)训练组和验证组中淋巴转移患者和非淋巴转移患者Radscore的差异。

表1 两组肺癌患者的临床资料和CT灌注参数

2.影像组学标签构建

将淋巴转移患者与非淋巴转移患者按照7：3的比例随机分层纳入训练组和验证组。训练组中淋巴转移患者共计22例，非淋巴转移患者19例；验证组中淋巴转移患者共计9，非淋巴转移患者7例。基于CT灌注图像共提取396个纹理特征参数，其中分别包括直方图参数(histogram parameters)，纹理特征(texture parameters)，形态参数(form factor parameters)，灰度共生矩阵(grey level of co-occurrence matrix，GLCM)，灰度游程矩阵(grey level run-length matrix，RLM)，灰度区域大小矩阵(grey level size zone matrix，GLZSM)。采用mRMR基于最小冗余最大相关进行特征去冗除杂，保留30个特征。采用LASSO (least absolute shrinkage and selection operator)进行数据降维并构建影像组学标签radscore，并进行五倍交叉验证，本研究中选择最小惩罚系数logλ=0.867时，对应的影像组学特征数共计6个(图1)。分别为：Quantile0.025、ClusterShade_angle45_offset7、GLCMEntropy_angle45_offset1、HighGreyLevelRunEmphasis_AllDirection_offset7_SD、ClusterShade_angle0_offset1、LowGreyLevelRunEmphasis_AllDirection_offset7_SD。构建Radscore的权重系数(图2a)。基于训练组Radscore构建公式如下：

图3 Radscore和CT灌注参数评估预测原发性肺癌患者淋巴转移的ROC曲线。a、d)Radscore预测训练组和验证组中患者淋巴转移的效能；b、e)MTT预测训练组和验证组中患者淋巴转移的效能；c、f)BV预测训练组和验证组中患者淋巴转移的效能。

图4 基于训练组Radscore以及CT灌注参数构建多元逻辑回归模型并做列线图以及该模型的诊断效能。a)多元逻辑回归模型Imagemodel的列线图；b)多元逻辑回归模型在训练组中与其他参数的诊断效能比较；c)多元逻辑回归模型在验证组中与其他参数的诊断效能比较。

Radscore=-0.17×Quantile0.025-0.479×ClusterShade_angle45_offset7-0.227×GLCMEntropy_angle45_offset1+0.017×HighGreyLevelRunEmphasis_AllDirection_offset7_SD-0.025×ClusterShade_angle0_offset1-0.03×LowGreyLevelRunEmphasis_AllDirection_offset7_SD+0.145

图5 模型矫正曲线。a)训练组拟合曲线；b)验证组拟合曲线。

基于Radscore计算公式，分别计算训练组以及验证组淋巴转移患者的Radscore，并采用非参统计训练组以及验证组淋巴转移患者与非淋巴转移患者之间的差异，训练组以及验证组中淋巴转移患者的Radscore均高于非淋巴转移患者，且差异具有统计学意义(P<0.0001 vsP=0.023，图2b)。

3.影像组学标签以及CT灌注参数诊断原发性肺癌淋巴转移的效能比较

首先基于训练组中淋巴转移与非淋巴转移患者的CT灌注参数进行非参检验，保留差异具有统计学意义的CT灌注参数，分别为MTT以及BV。分别对训练组和验证组中的淋巴转移患者与非淋巴转移患者进行ROC曲线分析，Radscore在训练组和验证组中的AUC分别为0.840、0.841。MTT在训练组和验证组中的AUC分别为0.687、0.698。BV在训练组和验证组中诊断效能AUC分别为0.672、0.698(表2，图3)。

表2 影像组学标签以及CT灌注参数预测肺癌淋巴转移的效能

4.影像组学标签联合CT灌注参数构建联合模型评估原发性肺癌淋巴转移风险

联合Radscore以及CT灌注参数构建多元逻辑回归模型Imagemodel，并制作模型列线图(图4a)。该模型中纳入Radscore、BV和MTT三项参数建立多元逻辑回归模型。模型计算公式为Y=1/[1+e-(2.343-0.382×BV+0.082×MTT+3.969×Radscore)]，利用列线图可快速得出Y值及Risk值，在已知MTT、BV和Radscore值时，分别基于列线上的值做出垂直线于Points上得到各个参数的得分，最终相加得到Risk值，即为患者淋巴转移的风险值(图4a)。联合模型的诊断效能在训练组和验证组中分别为0.885和0.802。Image model的诊断效能在训练组中高于Radscore、BV、MTT以及CT参数联合模型(P=0.378、0.014、0.010、0.030，图4b)。Image model的诊断效能在验证组中低于Radscore(图4c)，差异无统计学意义(P=0.533)，高于BV、MTT以及CT参数联合模型，差异无统计学意义(P=0.563、0.631、0.093)。利用Hosmer-Lemeshow检验显示训练组以及验证组中的模型与实际观察值差异均无统计学意义(P>0.05)，显示模型未偏离拟合(图5)。

讨 论

本组研究基于CT灌注图像分别提取CT灌注参数：BV、BF、MTT、PMB以及396个影像组学参数。首先基于训练组数据对影像组学进行特征降维构建影像组学标签Radscore；训练组中Radscore以及CT灌注参数BV、MTT单个参数对MLNM均具有较好效能(AUC=0.840、0.672、0.687)。联合Radscore以及CT灌注参数通过多元逻辑回归构建联合模型Image model，并采用Nomogram列线图视觉化Image model，Image model在训练组中诊断效能比Radscore、BV以及MTT提高。

肿瘤血管增生属于肿瘤转移以及预后的重要风险因素[17-18]。淋巴系统由淋巴管、淋巴、淋巴结和淋巴细胞组成。近年来中针对肿瘤淋巴转移的研究显示，肿瘤细胞可能直接由肿瘤组织中的微血管系统进入血管-淋巴管系统，导致淋巴转移；同时由于肿瘤组织中的淋巴管的生成，导致肿瘤细胞直接入侵淋巴管[19]；因此NSCLC的纵隔淋巴转移与肿瘤的微血管环境具有密切关系。低辐射剂量CT灌注提取灌注参数：BV、MTT、BF、PMB可用于定量无侵袭性评估肿瘤的血管生成情况，BV反映了兴趣区域中血管的体积，BF反映了兴趣区域中血流量，MTT则反映了对比剂通过兴趣区域的平均时间，PMB则反映了兴趣区域的血管通透性。研究显示，当兴趣区域中血管增生时，BV/BF升高，PS相应升高，因此CT灌注参数可用于定量评估肿瘤的微血管环境的改变[20]。本研究中，基于低辐射剂量的CT灌注提取灌注参数后，BV与MTT在训练组中的MLNM与非MLNM中具有显著差异，因此采用ROC评估BV与MTT的诊断效能，AUC分别>0.5，说明诊断效能较好，然而与Huang等[12]的研究不相符，该研究认为BF可有效诊断NSCLC淋巴转移，由于目前针对NSCLC纵隔淋巴转移研究相对较少，该差异可能是由于患者个体间的差异造成。

肿瘤异质性根本原因则是肿瘤基因表达受到调控，2020 NSCLC诊疗指南中明确提出不同基因型的NSCLC采用的治疗方案不同[3]，例如Wang等[21]发现EGFR突变的不同NSCLC其MLNM的发生存在显著差异，由于基因表达的异常，导致肿瘤细胞的表面蛋白的表达异常，从而改变肿瘤细胞的生理特性，例如粘附性改变，从而导致肿瘤细胞的迁徙性改变。Lambin等[22]提出实体瘤由于其基因表达的异常导致肿瘤异质性从而体现在肿瘤的表观形态上，随着成像技术的发展，利用Radiomics提取大量图像特征，可以反映肿瘤的异质性。本研究中基于低剂量CT灌注图像提取海量影像组学参数，构建影像组学标签Radscore，其诊断效能无论是训练组(0.840 vs 0.672、0.687)还是验证组(0.841 vs 0.698、0.698)中高于单个CT灌注参数，因此Radscore可以作为一个影像特征评估NSCLC是否发生MLNM。

由于肿瘤的微血管生成以及肿瘤异质性均与MLNM相关[23]，因此本次研究联合Radscore以及CT灌注参数 (MTT、BV)构建多元逻辑回归模型，Image model则包含了肿瘤异质性与肿瘤微血管生成的两种类型特征，在训练组中联合模型的诊断效能高于BV和MTT(P=0.014,0.010)；虽然Image model的诊断效能高于Radscore，但差异无统计学意义(P=0.378)。Image model的诊断效能在验证组中低于Radscore，差异无统计学意义(P=0.533)，高于BV、MTT以及CT参数联合模型，差异无统计学意义(P=0.563、0.631、0.093)。最终，笔者对Image model采用列线图使模型视觉化易于临床操作分析。

本次研究仍存在不足之处：样本量相对较少；未采取多中心临床试验进行验证。因此，在之后的临床试验中，将继续扩大临床样本以及多中心试验去进一步探索Image model、Radscore及CT灌注参数的诊断效能。

综上，本研究中基于低剂量CT灌注图像提取的灌注参数以及海量影像组学特征构建Radscore均可较好的诊断MLNM；联合CT灌注参数以及影像组学标签Radscore构建的联合模型Image model对MLNM具有良好的诊断效能，因此笔者尝试通过影像学的途径建立无侵袭性评估MLNM的模型，旨在为临床上评估MLNM提供新途径。