利用酵母双杂交技术筛选炭疽菌中与CsSSK1相互作用的蛋白质

方思齐 李泽栋 王记圆 何其光 李潇 刘文波 张宇 林春花 缪卫国

摘  要：炭疽菌（Colletotrichum siamense）是橡胶树等多种热带作物炭疽病的主要病原。双组分系统（two component system）在病原真菌中参与菌体对外界环境变化的适应、耐药性和毒力的调控。该系统包括感受器和应答调节蛋白，SSK1（SLF-interacting SKP1-like1）是双组分系统中的应答调节蛋白。为了了解炭疽菌中SSK1互作蛋白，本研究克隆获得橡胶树炭疽菌的一个应答调节蛋白编码基因CsSSK1，大小为2750 bp，cDNA大小为2190 bp，编码729个氨基酸，包含1个内含子，具有1个cheY同系物接收结构域和10个复杂结构。并利用酵母双杂交技术，在橡胶树炭疽菌cDNA文库中对CsSSK1互作蛋白进行筛选，共筛选到10个互作蛋白，分别为转酮醇酶、金属内酰胺酶、锌乙醇脱氢酶、泛素亚型X1、微管蛋白以及5个未知或假定蛋白。该结果为进一步研究CsSSK1的功能、互作蛋白及调节机制提供基础。

关键词：橡胶树炭疽菌;双组分系统;应答调节蛋白SSK1;互作蛋白

中图分类号：S763.7      文献标识码：A

Abstract： Colletotrichum siamense is the main pathogen of anthracnose of rubber tree or other tropical crops. A two component system is involved in the adaptation of fungi to external environmental changes， drug resistance and virulence in pathogenic fungi. In pathogenic fungi， it includes receptors and SSK1 （SLF-interacting SKP1-like1） response regulatory protein components. To obtain proteins interacting with SSK1 in C. siamense， a homologue gene CsSSK1， 2750 bp long with cDNA 2190 bp， was cloned. It contained a cheY homologs receiving domains and 10 complex structures. Then the pGBKT7-CsSSK1 vector was constructed. By an yeast two hybrid system， ten proteins， including transketolase， β-lactamase， alcohol dehydrogenase， ubiquitin， tubulin and 5 unknown or hypothetical proteins， maight interacting with CsSSK1， were identified after sequencing and bioinformatics analysis. This result would provide a basis for further study of the functions， interaction proteins and regulatory mechanism of CsSSK1.

Keywords： Colletotrichum siamense; two component system; response regulatory protein SSK1; interaction protein

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.027

双组分系统（two-component signaling system， TCS）是广泛存在于细菌、真菌、粘菌及高等植物的一类信号传导系统[1]。在病原真菌中，该途径参与细胞新陈代谢和生理生化过程，包括细胞能动性、细胞周期的控制、发育、对胁迫的耐受性、以及致病细菌和真菌的致病性过程等[1]。真核生物的双组分系统通常由3个部分组成：组氨酸激酶（histidine kinase， HK）、组氨酸基团的磷酸转移蛋白（HPt）、应答调节蛋白（response regulator， RR）[2]。例如，模式生物酵母的双组分系统由Sln1-Ypd1-Ssk1组成，Sln1作为杂合型组氨酸激酶感受器（HK），需要Ypd1（HPt）和Ssk1（RR）来继续磷酸基团的转移[3]。已有研究证明双组分信号系统对于病原真菌Aspergillus fumigatus、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Blastomyces dermatitidis和Histoplasma capsulatum的毒性和抗藥性的重要性[4]。

SSK1作为双组分系统中的应答调节蛋白（RR），在真核细胞中充当接受和传递信号的功能，即将双组分系统中的磷酸基团从Ypd1p转移至下游HOG MAPK（high-osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase）途径中的MAPKKK（mitogen-activated protein kinase kinase kinase）的角色[5-7]。HOG MAPK信号途径在真菌诱导胁迫反应、信息素反应、细胞形态恢复、致病性和抗药性等方面都起着重要作用[8-9]。该信号途径主要由MAPK（Hog1p）、MAPKK（Pbs2p）、和MAPKKK（Ste11p，Ssk2p和Ssk22p）组成[8]。已有研究显示，SSK1与病原菌的毒力和对各种胁迫的反应有关。例如，在稻瘟病病原Pyricularia oryzae中，双组分系统2个RR基因（MoSSK1和MoSKN7）共同调控稻瘟菌对于渗透压和咯菌腈的敏感性，还参与病原毒性[1， 9-10]，在病原真菌Botrytis cinerea中的SSK1与毒性相关[10];Beauveria bassiana的SSK1也与病原菌毒力和对渗透压的抗性相关[11]。但也有研究报道SSK1在不同真菌中功能有差异，如在Kluyveromyces lactis中，SSK1缺失后，突变体对高渗透压的敏感性没有发生改变[12]，然而，在Candida albicans中，SSK1缺失突变体比野生型对高盐具有更高的敏感性[4]。在Vertilillium dahliae中，该基因还与病原菌的压力胁迫反应、黑色素的合成和致病力相关[13]。

橡胶树炭疽病是橡胶树叶部的重要病害，炭疽菌（Colletotrichum siamense）是我国橡胶树炭疽病的主要病原种类[14-15]，也是热带作物炭疽病的主要病原种类[16]。项目组前期研究显示橡胶树炭疽菌HOG MAPK途径参与调控菌体对渗透压和咯菌腈敏感性的功能[17];已有研究表明：SSK1作为传递信号至HOG MAPK途径的角色，且也参与了病原真菌在压力胁迫、药剂敏感性、菌体毒性类似功能[1， 9-12]。二者存在何种关系？SSK1在菌体内是否有其他互作蛋白？是否调控其他蛋白的功能等方面知之甚少。基于前期已經构建了橡胶树的炭疽菌（C. siamense）cDNA酵母文库的基础上，本研究克隆获得炭疽菌SSK1同源基因CsSSK1基因，构建诱饵载体pGBKT7-CsSSK1，利用酵母双杂交技术从橡胶树炭疽菌cDNA文库中筛选互作蛋白，该研究结果可为进一步了解CsSSK1的互作蛋白及功能，了解真菌双组分系统的功能，以及菌体在压力胁迫、药剂敏感性、菌体毒性的调控机理奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株及质粒  橡胶树炭疽菌（C. siamense）HN08菌株分离自海南省琼中新进农场橡胶树病叶，由本实验室分离鉴定保存[15];大肠杆菌Escherichia coli DH5α和载体PMD-18T购自大连TaKaRa公司;酵母感受态细胞（Y2HGold Chemically Competent Cell）购自于上海唯地生物技术有限公司;质粒pGADT7、pGBKT7由本实验室保存。橡胶树炭疽菌酵母双杂交cDNA文库由本实验室构建保存。

1.1.2  试剂  限制性内切酶（EcoRⅠ，BamHⅠ）购自宝生物工程（大连）有限公司;植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）购自天根生化科技（北京）有限公司;凝胶DNA小量回收试剂盒（Hipure Gel pure DNA Mini Kit）购自海南立菲特生物科技有限公司;高保真DNA聚合酶、蛋白质Marker、DNA Marker、RNA反转录试剂盒One-step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super Mix购自北京全式金生物技术有限公司;质粒提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司;T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.1.3  培养基  马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，固体加入琼脂18～20 g/L。

完全培养基（CM）：酸水解酪蛋白1 g/L，蔗糖10 g/L，酵母提取物6 g/L，固体加入琼脂18～20 g/L。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，固体加入琼脂15～18 g/L，pH调节至7.5。

酵母选择营养二缺培养基（SD/-Trp-Leu）：酵母氮源6.7 g/L，Trp/-Leu Droupout 0.64 g/L，葡萄糖20 g/L，调节pH到5.8。

酵母选择营养四缺培养基（SD/-Trp-Leu- His-Ade）：酵母氮源6.7 g/L，Trp/-Leu/-His/-Ade Droupout 0.64 g/L，葡萄糖20 g/L，调节pH到5.8。

酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（YPDA）：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸腺嘌呤0.03 g/L。

1.2  方法

1.2.1  橡胶树炭疽菌C. siamense CsSSK1基因的克隆和分析  橡胶树炭疽菌HN08菌株的总RNA提取使用多糖多酚植物RNA提取试剂盒[购自于天根生化科技北（北京）有限公司]，按照说明书进行提取。对提取产物进行纯度和完整性的检测，符合目标要求的RNA按照cDNA Synthesis SuperMxi（全式金公司）操作说明书反转录合成cDNA备用。

根据NCBI数据库中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SSK1序列（Gene ID： 850692），采用本地BLAST方法，从橡胶树炭疽菌基因组中搜索获得同源序列，根据序列设计引物对pGBKT7-SSK1-F（5-CCGGAATTCATGGGTGCC CACAAGCCACA-3）/pGBKT7-SSK1-R（5-CGC GGATCCCTACTTCGGTATTACGCTGCGGAAC-3）。以橡胶树炭疽菌cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。并将PCR产物回收连接载体PMD-18T获得重组质粒，连接产物转化感受态细胞DH5α，经过PCR验证正确后挑取阳性转化子，送往深圳华大基因研究院测序，重复3次。

比较分析DNA和cDNA序列，了解外显子和内含子，并与GenBank中同源序列进行分析，利用NCBI网站上的BLASTx软件完成。cDNA序列翻译成氨基酸序列，利用在线的简单模块构架搜索工具（simple modular architecture research tool， SMART; http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/ set_mode.cgi）对氨基酸序列进行结构功能域分析[18]。

1.2.2  pGBKT7-CsSSK1诱饵载体的构建  提取上文中测序成功的阳性转化子质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，将酶切下来的CsSSK1片段使用T4 DNA连接酶[购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司]与已经用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切完成的pGBKT7载体在16 ℃连接过夜，转入大肠杆菌DH5α感受态中，并对验证正确的阳性克隆进行酶切验证。

1.2.3  诱饵表达载体毒性及自激活验证  将重组的载体pGBKT7-CsSSK1和pGADT7转入酵母感受态Y2HGold中，涂布于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp- Leu-His-Ade营养缺失培养基上，30 ℃培养3～5 d。

1.2.4  酵母双杂交文库筛选与回复试验验证  将提取的pGBKT7-CsSSK1质粒转入酵母感受态Y2HGold中，并挑选在SD-Trp平板中生长正常的酵母单克隆，进行PCR验证。挑取转有重组质粒的Y2HGold酵母菌株单菌落接种于50 mL的SD-Trp液体培养基中，把5 mL轉有诱饵基因的Y2HGold酵母菌液和1 mL橡胶树胶孢炭疽菌cDNA文库（Y187）合并在一个2 L的锥形瓶中，并加入45 mL的2×YPDA，30 ℃ 40 r/min培养24 h。用50 mL离心管1000 g离心10 min，收集菌体后用10 mL的0.5×YPDA溶液（卡纳终浓度50 ?g/mL）重悬菌体，涂布于SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基上，3～5 d后挑选正常生长的酵母单克隆，转板到SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基上，重复3次。3次转板后仍正常生长的酵母单克隆用于做PCR验证。提取酵母质粒验证后将阳性克隆质粒转入大肠杆菌，送华大公司测序。去除重复的单克隆后将正确的菌种保存于-80 ℃冰箱。提取测序正确的互作蛋白质粒与诱饵载体pGBKT7-CsSSK1质粒共同转化酵母感受态Y2HGold中，涂布在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基平板上，30 ℃培养箱中倒置培养3～5 d。

2  结果与分析

2.1  橡胶树炭疽菌CsSSK1基因的克隆及序列分析

以橡胶树炭疽菌C. siamense HN08总RNA反转录获得的cDNA和DNA为模板，分别扩增获得目的条带（图1）。测序后得到橡胶树炭疽菌CsSSK1基因序列，序列登录号为ID：MN624171。测序分析结果显示，扩增获得的CsSSK1基因序列包含完整的开放阅读框架数据，DNA序列大小为2750 bp，cDNA序列大小为2190 bp，该基因含有1个内含子，编码729个氨基酸，含有1个cheY同系物接收结构域和10个复杂结构，cheY结构域包含1个被组氨酸激酶同源物磷酸化的磷酸受体位点（图2）。

2.2  诱饵载体pGBKT7-CsSSK1构建及重组质粒自激活检测

将扩增得到的CsSSK1目的片段，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切得到目的片段，T4连接酶连接载体pGBKT7。用通用引物pGBKT7-F（5-TAATAC GACTCACTATAGGGC-3）/pGBKT7-R（5-AGATG GTGCACGATGCACAG-3）进行菌落PCR验证，得到目的片段大小约为2190 bp。进行EcoRⅠ和BamHⅠ酶切验证（图3），再经测序验证后保存阳性克隆待用。

将重组诱饵载体pGBKT7-CsSSK1与pGADT7空载体共转化酵母感受态Y2HGlod，涂布于SD/-Trp-Leu缺陷培养基平板上长出酵母菌落（图4A），说明pGBKT7-CsSSK1能够在酵母菌株Y2HGold中成功表达，表达产物对宿主酵母菌没有产生毒性。SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基平板上没有菌落生长（图4B），说明pGBKT7- CsSSK1没有自激活现象。

2.3  酵母文库的筛选和阳性克隆测序分析

以pGBKT7-CsSSK1为诱饵蛋白，从炭疽菌cDNA酵母文库中筛选阳性克隆，在SD/-Trp-Leu- His-Ade缺陷培养基上重复筛选3次，得到27个阳性克隆。提取这些阳性克隆的DNA为模板，用引物对pGBKT7-F/R进行PCR验证，结果显示扩增出条带的单克隆有23个，扩增获得的片段大小在500～2000 bp之间（图5）。

将23个阳性克隆的酵母质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞内进行扩增，进而提取质粒送华大测序。对测序结果进行分析，排除重复序列，在NCBI数据库中进行Blastx分析，结果显示获得10个候选互作蛋白，它们分别为：转酮醇酶（transketolase）、金属内酰胺酶（β-lactamase）、锌乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）、泛素亚型X1（ubiquitin）、微管蛋白（tubulin）以及5个未知或假定蛋白（表1）。

2.4  酵母双杂交点对点回复验证

将酵母双杂交得到的10个阳性克隆提取质粒，逐一与诱饵载体pGBKT7-CsSSK1质粒共同转化酵母感受态Y2HGlod后，结果显示筛选到的10个阳性克隆都可以在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基正常生长。说明10个阳性克隆在酵母体内与CsSSK1产生互作（图6）。

3  讨论

炭疽病是橡胶树重要叶部病害之一，国内外对橡胶树炭疽菌致病性和抗药性分子机理的研究基础相对薄弱。SLN1-YPD1-SSK1级联反应是酿酒酵母中参与渗透协调的双组分系统。在病原真菌中，该系统还参与耐药性和毒力的调控[19]。组氨酸激酶（SLN1）感受外界压力自磷酸化，然后将磷酸基团传递给磷酸转移蛋白（YPD1），再将磷酸基团传递给应答调节蛋白（SSK1）。现有的研究多在转录水平研究SSK1调控哪些基因？这些基因参与哪些功能？研究表明，SSK1在真核细胞中充当接受和传递信号的功能，在高渗胁迫时，SSK1可迅速发生磷酸化，并激活下游HOG MAPK级联反应，从而诱导细胞内甘油合成，促使细胞适应渗透压[19-20]。在这个过程中，已证实SLN1和SSK1都可与YPD1疏水区结合[20]。此外，在酿酒酵母中，用DNA微列阵方法，鉴定出SSK1还可以调控细胞壁合成相关基因，如AHP1、HSP12、PYC2等，进而调控细胞对氧化胁迫的调节[10]。但除了YPD1外，目前未见关于SSK1与其他蛋白直接互作的报道。本研究克隆了以炭疽菌CsSSK1基因，并以该基因编码蛋白为诱饵，利用酵母双杂交技术对橡胶树炭疽菌cDNA文库进行筛选，结果显示获得的互作蛋白有转酮醇酶、金属β-内酰胺酶、乙醇脱氢酶、微管蛋白及泛素亚型X1等。该结果表明SSK1作为双组分系统的应答调节蛋白，不仅可以与YPD1互作，通过转移磷酸基团调控HOG MAPK途径，可能还与其他蛋白相互作用存在其他功能，该研究结果为进一步研究CsSSK1的功能奠定基础。

轉酮醇酶（transketolase）在戊糖磷酸酸循环以及光合成的还原型戊糖磷酸循环中起着重要作用[21]。有研究报道转酮醇酶在稻瘟病的侵染中起到至关重要的作用，缺乏转酮醇酶的病原菌可以顺利产生附着胞并成功侵染，病原菌可以在细胞间存活，但是其有丝分裂过程变慢，影响病原菌在寄主细胞内维持营养生长以及在细胞间的移动，加入外源ATP后此过程恢复正常[22]。本研究初步显示CsSSK1可与转酮醇酶发生体外互作，CsSSK1是否通过与转酮醇酶互作，影响病原菌的侵染和生长，值得深入研究。

金属β-内酰胺酶是一种水解酶，在细菌中研究较多，与细菌耐药机制有关，可以催化水解β-内酰胺类抗生素的特征性四元环，进而使β-内酰胺类结构发生改变产生无效产物，最终导致该类抗生素失去抗菌活性[23]。已有研究证明SSK1对病原真菌的抗药性有一定影响[13]，本研究初步显示CsSSK1与金属β-内酰胺酶互作。病原真菌炭疽菌是否也通过SSK1调控金属β-内酰胺酶活性，从而调控菌体的抗药性，需要进一步进行验证。

除此之外，乙醇脱氢酶、微管蛋白、泛素亚型X1为筛选获得的假定蛋白，它们与SSK1是否确实存在互作关系？互作的生物学意义又是什么？都有待进一步验证。本研究仅仅是通过酵母双杂交方法获得的互作蛋白，由于酵母是简单的真核生物，其蛋白质加工、修饰类型及程度与炭疽菌可能存在差异，因此酵母双杂的结果只是提示互相作用的可能性，后续还需要通过Co-IP、BiFC等技术对它们的互作性进行验证。该研究结果可为进一步开展SSK1互作蛋白及丰富其功能研究奠定基础。

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责任编辑：谢龙莲