血橙花色苷大孔树脂纯化工艺及抗氧化研究

胥 萍，林小靖，付红伟

(1.浙江大学自贡创新中心，四川自贡 643000；2.浙江大学华南工业研究院，广东广州 510000；3.浙江大学，浙江杭州 310000)

血橙[CitrussinensisL.(Osbeck)]属于芸香科柑橘属甜橙类[1]，果实含有丰富的活性物质，如花色苷、类黄酮、羟基肉桂酸、抗坏血酸等[2-3]。花色苷的含量被认为是血橙果实的重要品质指标，其抗氧化活性对人体健康也具有重要意义[4]。血橙中含有的花色苷对人体健康有益，可以抗癌、预防糖尿病和心脏病(动脉硬化)、抗氧化及抗衰老等[5-6]。大孔树脂是一类具有大孔结构的有机聚合物吸附剂，广泛应用于生物化学上的分离纯化。大孔树脂相比于其他的纯化方式，具有大孔网状结构和大比表面积、吸附速度快、选择性好、可循环使用且再生处理经济环保、方便制剂成型等优势[7-8]。本实验比较了四种大孔树脂对血橙花色苷的吸附分离效果，对其吸附解吸性能进行研究，旨在从中筛选出较为合适的血橙花色苷分离纯化树脂类型。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

血橙果实采摘自四川省资中县血橙基地。大孔树脂D101、HPD-300、NKA-9：沧州宝恩化工公司；大孔树脂AB-8：天津允开公司。柠檬酸、氯化钾和盐酸：广州试剂厂。

紫外可见分光光度计：岛津 UV-1800；摇床：江苏太仓TH2-C-1；pH计：赛多利斯PB-10。

1.2 实验方法

1.2.1 血橙花色苷粗品制备

将新鲜血橙果实去皮后打成匀浆，将其置于离心机4 000 r·min-1离心15 min，取上清液备用，即得血橙花色苷粗品[9]。

1.2.2 pH差示法测定血橙花色苷含量

参考文献[9]，采用pH差示法测定血橙花色苷含量。

准确称取1.00 g的各类型大孔吸附树脂，置于具塞锥形瓶中，加入血橙花色苷粗品20 mL，在25 ℃恒温条件下以120 r·min-1的转速搅拌3 h。测定花色苷的含量，实验设3个平行试验。吸附平衡后，先用去离子水洗涤2次后，再加入10 mL的50%乙醇到含有1.00 g吸附饱和树脂的具塞锥形瓶中。在25 ℃恒温条件下以120 r·min-1的速度震荡1 h。测定解吸后的花色苷含量，计算不同型号树脂的吸附率和解吸率。吸附率和解吸率计算公式如下：

吸附率=(C1-C2)/C1×100%

解吸率=C3/(C1-C2)×100%

上式中，C1为溶液在吸附前的花色苷含量，C2为吸附完全后的花色苷含量，C3为经过吸附后解吸液的花色苷含量。

1.2.4 确定血橙花色苷大孔树脂的最佳吸附时间

称取上述试验筛选出的大孔吸附树脂1.00 g，置于具塞锥形瓶中，加入血橙花色苷粗品20 mL，放于摇床中，震荡转速为120 r·min-1，在不同时间测定吸附液中血橙花色苷的含量，直至达到平衡。实验设3个平行试验。

1.2.5 不同浓度乙醇对大孔吸附树脂静态解吸血橙花色苷影响

称量1.00 g吸附饱和花色苷的大孔树脂，分别加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%乙醇洗脱液10 mL，测定溶液中花色苷的含量。实验设3个平行试验。

1.2.5.2 攻毒。于14日龄将制备的IBDV悬液采用滴眼、刷肛法对Ⅰ～Ⅳ组试验鸡进行攻毒，攻毒剂量为0.5 mL/只。攻毒后24～48 h试验鸡均出现典型的IBD症状；攻毒后60～72 h出现死亡。通过对解剖死亡鸡的观察发现鸡的胸肌、腿肌均有血斑，法氏囊和肾脏肿大，触之坚硬，肾脏有尿酸沉积[4]，表现为典型的IBD症状，攻毒有效率为100%。

1.2.6 洗脱液pH对大孔吸附树脂静态解吸血橙花色苷的影响

称取吸附饱和花色苷的大孔树脂1.00 g于10 mL pH值分别为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的60%乙醇解吸液中，测定解吸后的花色苷含量。实验设3个平行试验。

1.2.7 树脂吸附血橙花色苷泄露曲线的绘制

取10 mL预处理后的大孔树脂，湿填料于柱中，然后流速为2 mL·min-1上样。流出液每10 mL收集1次流份，并测定每个流份的吸光值，当流出液的花色苷含量达到上样液花色苷含量的1/10时，认为已经有花色苷泄露，据此绘制泄露曲线[10]。

1.2.8 大孔树脂动态解吸体积测定

量取10 mL预处理后的树脂进行湿法装柱，血橙花色苷粗品上样于树脂柱达到吸附饱和后先用去离子水洗涤，再用60%乙醇洗脱，洗脱流速为2 mL·min-1，每10 mL收集1次流份，并测定每个流份的吸光值，据此绘制洗脱曲线。

1.2.9 血橙花色苷色价测定

参照《中国人民共和国国家标准GB6718-86》方法测定血橙花色苷色价。

1.2.10 血橙花色苷清除DPPH自由基能力测定

配制 0.06 mmol·L-1DPPH溶液，取5 mL DPPH溶液加入1 mL的待测溶液，摇匀，避光反应30 min。每个样品做三个平行。以去离子水为参比，在518 nm处测各待测液的吸光值，然后计算清除率。

1.2.11 血橙花色苷清除ABTS自由基能力测定

配制7 mmol·L-1ABTS溶液，加入0.88 mL(14 mmol·L-1)过硫酸钾溶液，室温避光静置过夜，用无水乙醇稀释此液至734 nm处测得的吸光度为 0.70±0.02，即得ABTS工作液。取7.8 mL ABTS工作液加入200 μL的待测液，摇匀，避光反应10 min。每个样品做三个平行。以去离子水为参比，在734 nm处测各待测液的吸光值，然后计算清除率。

2 结果与分析

2.1 四种大孔树脂对血橙花色苷的静态吸附与解吸作用

由表1可以看出，四种大孔树脂对血橙花色苷均有一定的吸附作用，树脂的吸附和解吸性能与树脂的性质和溶质的化学性质有关。其中树脂D101、HPD-300略高于其余2种树脂，表明在静态吸附阶段，D101、HPD-300可以更好地吸附和保护花色苷，避免花色苷的损失。D101、AB-8大孔树脂的解吸率较高，分别为65%、64%，说明在该解吸条件下D-101和AB-8相比于另外2种大孔树脂能释放更多的花色苷。通过以上分析可见，D101大孔树脂对血橙花色苷的吸附和分离效果较好，于是对D101大孔树脂进行了后续实验。

表1 血橙花色苷在不同大孔树脂上的吸附率和解吸率

2.2 大孔树脂吸附花色苷的时间

由图1可见，D101对血橙花色苷的吸附率在前0.5 h快速增加，1 h后缓慢增加，在2 h左右达到平衡，说明血橙花色苷在D101大孔树脂上吸附2 h已经达到了平衡。

图1 D101大孔树脂对花色苷的静态吸附作用

2.3 不同解吸液乙醇浓度对血橙花色苷静态解吸的影响

为了选择合适的解吸溶液，采用不同浓度的乙醇水溶液进行了解吸试验。由表2结果可知，解吸率随乙醇浓度的增加而增大，在60%浓度时达到峰值，然后随乙醇浓度的增加而减小。因此，选择60%乙醇水溶液作为花色苷的合适解吸溶液，用于花色苷的动态解吸实验。

表2 不同的解吸液乙醇浓度对血橙花色苷静态解吸的影响

2.4 不同解吸液pH对血橙花色苷静态解吸的影响

不同解吸液pH对血橙花色苷解吸的影响表现为随着pH值的升高，D101大孔树脂对血橙花色苷的吸附率逐渐降低(见表3)，这与较高pH值条件下花色苷的稳定性较差有关。但pH值为1.0、2.0时的花色苷吸附率相差不多，由于较低的pH值容易使花色苷的糖基发生水解现象，影响花色苷分子的稳定性，吸附率下降，因此选择pH值2.0最适合。

表3 解吸液pH值对解吸效果的影响

2.5 上样体积对大孔吸附树脂动态吸附血橙花色苷的影响

D101大孔树脂对血橙花色苷的吸附泄漏曲线(见图2)显示，D101对血橙花色苷吸附量随着上样溶液体积的增大而增大，流出液体积由1 BV到10 BV的过程中，其吸光值的增加幅度较缓，而当流出液体积由10 BV上升到11 BV时吸光值的增加幅度明显加大，出现了明显差异。当流出液体积为11 BV时其吸光值已达到上样溶液含量的1/10，即出现泄漏。

图2 D101大孔树脂对血橙花色苷的吸附泄漏曲线

2.6 大孔树脂动态解吸体积测定

由图3可以看出，酸化60%乙醇可洗脱D101大孔树脂吸附的大部分花色苷，在前1 BV时即有检测到花色苷流出，当洗脱体积达到8 BV时已洗脱出上样花色苷总量的96%。

图3 D101大孔树脂动态解吸曲线

2.7 纯化后花色苷产品色价测定

本实验表明，经D101大孔树脂纯化后，血橙花色苷色价为48.4，呈现为红色膏状物；而未纯化的血橙花色苷色价为0.8，呈现深红色。

2.8 血橙花色苷清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是稳定的紫色自由基，可以用来衡量抗脂质氧化能力[11]。由图4可见，血橙花色苷在浓度为(0.15～1.50 mg·mL-1)的范围内，随添加浓度的增大，对DPPH自由基的清除率随之增大，清除率最高可达92.7%，IC50为0.437 mg·mL-1。

图4 血橙花色苷清除DPPH自由基的能力

2.9 血橙花色苷清除ABTS自由基的能力

ABTS为一稳定的有机自由基，对其清除的能力直接反映出样品抗氧化能力的大小[11]。由图5可见，血橙花色苷在浓度为(0.22～1.63 mg·mL-1)的范围内，随添加浓度的增大，对ABTS自由基的清除率随之增大，清除率最高可达89.2%，IC50为0.680 mg·mL-1。

图5 血橙花色苷清除ABTS自由基的能力

3 结论

D101大孔树脂对血橙中花色苷具有良好的吸附和解吸能力。吸附和解吸的最佳条件：上样体积为10 BV，在2 h静附后，大孔吸附树脂的静态吸附达到饱和，洗脱溶剂用pH值为2的60%乙醇，洗脱体积为8 BV。纯化后的血橙花色苷为深红色粉末。血橙花色苷具有较好的抗氧化性能，在一定的浓度范围内，对DPPH自由基和ABTS自由基有一定的清除作用，其作用随浓度的增加而增强。