益生菌微胶囊化对仔猪生长性能及免疫功能的影响

刘耀东， 贾荣玲， 王国强

（南阳农业职业学院，河南南阳473007）

益生菌能够改善肠道环境， 维持其生态平衡（周莉等，2019）， 还有利于维持肠道菌群平衡（Bailey 等，2017），增强胃肠道黏膜屏障（雷艳琴，2008）， 可作为饲料添加剂来补充肠道微生物，具有免疫调节（Jin 等，2011；何国庆等，2004）、促进营养物质吸收 （韩璐瑶，2019；Leslie，2015； 李琴等，2004）等功能。 胃肠道环境恶劣，尤其是胃酸，会降低益生菌活菌数量， 大大限制了其益生功能的发挥（Castrocialaghi 等，2012）。 微胶囊技术是近年来的一项保护生物活性物质的有效技术。 其给益生菌创造了一个合适的微环境， 使菌体与周边相对恶劣的自然环境隔离开， 从而达到益生菌长期保存的目标。应用微胶囊技术，经过一定的手段将益生菌包埋在微小且封闭的胶囊中 （程玉霞，2013），不仅能在加工或储藏过程中提高益生菌的有效活菌数， 还能在通过胃肠道期间对益生菌进行保护， 使其以较少的活性损失到达肠道靶位点（Yao 等，2017）。可有效加强菌体对消化道逆环境的抵抗力，并将益生菌在适当的位置释放，发挥其益生作用（Cook 等，2012；Carvajal 等，2007）。

本研究采取海藻酸钠和明胶双层复合包埋鼠李糖乳杆菌益生菌微胶囊。 该双层微胶囊能够保护益生菌活性（Zou 等，2011），并利用凝胶防止在胃中水解。在菌种培养过程中，加入半乳糖促进其生长，提高了包埋效率。并将微胶囊化鼠李糖乳杆菌用于仔猪饲料中， 测定其对仔猪生产性能和免疫功能的影响。 旨在为提供优质猪用生物制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材 鼠李糖乳杆菌 （ATCC 7469）（北京中科质检生物技术有限公司）、MRS 肉汤、MRS 培养基、莫匹罗星锂盐改良MRS 琼脂、海藻酸钠、明胶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钙、盐酸、氯化钠、柠檬酸、氢氧化钠等（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 仪器与设备 恒温水浴锅（上海一科仪器有限公司）、厌氧培养箱（常州金坛精达仪器制造有限公司）、电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、磁力搅拌器（上海越众仪器设备有限公司）、电子分析天平、立式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备有限公司）、高速离心机（德国Hettich公司）、旋涡振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、生物安全柜（苏州安泰二级生物安全柜）。

1.3 菌种的活化及菌悬液制备

1.3.1 菌种活化 将益生菌 （鼠李糖乳杆菌），接种于葡萄糖基础培养基（MRS 肉汤）中，37 ℃培育18 ～48 h，并进行活化传代。 离心，生理盐水洗涤，重悬。

1.3.2 增殖培养基的选择 选取半乳糖、 蔗糖增殖培养基和葡萄糖基础培养基， 各浓度均为：0.125%、0.25%、0.5%、1%、2%和 4%， 接入益生菌（鼠李糖乳杆菌）菌悬液中，厌氧培育，在600 nm下测定吸光度。

1.3.3 半乳糖对益生菌生长过程的影响 选择增殖效果较好的碳源浓度， 配制基础培养基和增殖培养基。 取活化后的益生菌（鼠李糖乳杆菌）菌悬液接种，无氧培育。 每隔4 h 在600 nm 下测定吸光度。

1.4 益生菌微胶囊的制备 按照唐仁龙（2018）的方法制作微胶囊，取海藻酸钠粉末溶于灭菌水中，70 ℃下水浴加热过夜至粉末充分溶解，制得海藻酸钠溶液， 并经过0.22 μm 滤膜过滤除菌，冷却备用。称取一定质量的明胶，制得明胶溶液。使用磁力搅拌器，搅拌悬浮1 h 后备用。 将菌液、明胶和海藻酸钠以1：1：1 比例混合，注射器滴入CaCl2固化剂中，形成微囊，磁力搅拌器搅拌，使微囊充分凝固，用蒸馏水冲洗3 次，除去多余的钙离子和未被包埋的益生菌，即得湿胶囊（周莉等，2020）。

1.5 计算微胶囊包埋效果 称取微胶囊1000 mg，加入 9 mL 解囊液中[PBS 缓冲液（pH 7.4）]（王婷婷，2016），振摇10 min 至完全解囊。稀释后涂板，厌氧培养计数。 微胶囊的包埋率计算公式如下：

1.6 微胶囊包埋工艺单因素试验 在其他条件不变的情况下，以包埋率为指标，测定海藻酸钠添加量（1%、2%、3%、5%和 8%），明胶浓度（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%和 0.3%）， 菌胶比例（1：2、1：4、1：8、1：10、1：20）、氯化钙浓度（1%、2%、3%、5%和 8%） 和搅拌速度 （200、400、600、800 r/min 和1000 r/min）对鼠李糖乳杆菌微胶囊包埋效果的影响，确定其最佳条件。

1.7 微胶囊包埋工艺优化 以单因素试验为基础进行正交试验， 并测定该条件下的益生菌微胶囊包埋率。

1.8 饲喂益生菌微胶囊对仔猪的影响 选取体重相近的22 日龄断奶三元杂交健康仔猪36 头（母本为长大，父本为杜洛克）随机分为4 组，每组9 头。 对照组饲喂基础日粮（表1），其他组分别饲喂添加0.1%、0.2%、0.3%益生菌微胶囊的日粮。预饲期10 d，正饲期30 d。 试验在封闭式猪舍内进行，自由采食，水泥地面圈养，以鸭嘴式饮水器提供充足清洁饮水。舍温23～27 ℃，随时观察并记录猪的状态。试验期间，按仔猪的常规免疫程序进行免疫、驱虫，并采用多种方式进行消毒。

表1 仔猪基础日粮组成及主要营养水平（风干基础）

2 结果与分析

2.1 鼠李糖乳杆菌菌种培养结果

2.1.1 增殖培养基对鼠李糖乳杆菌增殖作用的影响 由图1 可知，在葡萄糖、半乳糖、蔗糖培养基浓度相同时， 半乳糖培养基中的鼠李糖乳杆菌OD600nm值最高，达到1.98，由此可看出，半乳糖对鼠李糖乳杆菌的增殖培养效果较好。

2.1.2 半乳糖对鼠李糖乳杆菌生长过程的影响由图2 可知， 半乳糖培养基培养8 h 后进入快速生长期，在葡萄糖培养基中培养12 h 进入快速生长期，半乳糖培养基缩短了菌体延滞期，在12 h后半乳糖OD600nm值显著高于葡萄糖，说明半乳糖可提高鼠李糖乳杆菌的生长速率。

图1 培养基浓度对鼠李糖乳杆菌菌体数量的影响

图2 半乳糖对鼠李糖乳杆菌生长过程的影响

2.2 各因素对鼠李糖乳杆菌益生菌微胶囊的影响

2.2.1 海藻酸钠添加量对益生菌微胶囊的影响由图3 可知，在一定范围内，包埋率随海藻酸钠浓度的加大而增大，添加3%海藻酸钠时，包埋率为76.5%。 继续增大浓度，包埋率降低。 因此，将3%作为海藻酸钠最佳浓度。

图3 海藻酸钠对微胶囊包埋效果的影响

2.2.2 明胶浓度对益生菌微胶囊的影响 由图4可知，明胶浓度为0.2%时，微胶囊所包埋的菌落数最多，包埋的效果最好；明胶浓度大于0.2%时，包埋率反而降低。

图4 明胶浓度对微胶囊包埋率的影响

2.2.3 菌胶比例对益生菌微胶囊的影响 由图5可知，随着菌胶比例增大，包埋率无显著变化，在菌胶比例为1：10 时包埋率稍高；且形成的微胶囊膜逐渐变厚，成型效果变好。 所以，菌胶比例选择1：10。

图5 菌胶比例对微胶囊包埋率的影响

2.2.4 氯化钙添加量对益生菌微胶囊的影响 由图6 可知， 氯化钙添加量为2%时， 包埋率为76%，达到最高。氯化钙添加量大于2%时，包埋率降低，故最终选择氯化钙添加量为2%。

图6 氯化钙添加量对微胶囊包埋率的影响

2.2.5 搅拌速度对益生菌微胶囊的影响 由图7可知，随着搅拌速度的上升，包埋率呈上升趋势，到800 r/min 后包埋率下降。故最佳搅拌速度选用800 r/min。

图7 搅拌速度对微胶囊包埋率的影响

2.3 微胶囊包埋工艺优化 单因素试验为基础，选择海藻酸钠、明胶浓度、氯化钙浓度和搅拌速度设计正交试验。 正交试验设计和结果分别如表2、表3 所示。

表2 正交试验设计

表3 正交试验结果

单因素分析规律是试验因素对指标的影响呈正相关，极差顺序比较依次为：海藻酸钠浓度（A）＞明胶浓度（B）＞氯化钙浓度（C）＞搅拌速度（D）。所以对鼠李糖乳杆菌益生菌微胶囊包埋效果影响显著的是海藻酸钠，其次是明胶，然后是氯化钙，最后是搅拌速度。通过比较每个因素k 值大小，发现因素 A 为 A2，B 为 B2，C 为 C1，D 为 D2时，所对应的k 值均为每组中最大的， 因此最终制备条件为海藻酸钠3%，明胶0.2%，氯化钙2%，搅拌速度800 r/min。

2.4 试验验证 将试验进行三次重复，结果分别为75.6%、76.0%、76.4%，平均值为76.0%，与预测值较为相似， 说明试验能较好地反映微胶囊制备过程中4 个因素对于包埋率的影响， 从而证明此试验优化后的工艺条件是可靠的 （Kantas 等，2015）。

2.5 微胶囊对仔猪生长性能的影响

2.5.1 微胶囊的安全性评价 将制备的鼠李糖乳杆菌微胶囊喂食仔猪进行试验，喂养6 周，在此期间，仔猪的体重增长、精神状态、体毛、饮食、排便状况均无异常，各组期间生活状态较好。表明制备的微胶囊不存在安全隐患，使用安全。

2.5.2 对仔猪生产性能的影响 由表4 可见，随着益生菌添加剂量的提高，仔猪的末重、日增重及日采食量也不断提高， 当益生菌微胶囊饲喂添加量为0.3%时，仔猪的末重、日增重及日采食量均显著高于对照组， 料重比较对照组降低了3.7%；腹泻率较对照组降低了56.7%；试验结果表明，益生菌微胶囊添加剂量为0.3%时不仅能显著提高仔猪的生长速度，并且能够降低仔猪的腹泻率。

表4 益生菌微胶囊饲喂剂量对断奶仔猪生产性能的影响

2.5.3 对仔猪免疫功能的影响 由表5 可知，随着益生菌微胶囊饲喂剂量的增加，IgA、IgG 和IgM含量不断提升，其中，0.3%组的 IgA、IgG 和 IgM 均显著高于（P ＜0.05）对照组，表明将益生菌微胶囊添加到日粮中能够提高仔猪的免疫能力，以0.3%添加剂量最佳。

表5 益生菌微胶囊饲喂剂量对仔猪免疫功能的影响 g/L

3 讨论及结论

本试验制备的鼠李糖乳杆菌微胶囊， 包埋率较为理想，随着海藻酸钠浓度的升高，形成良好的机械强度， 能有效包埋鼠李糖乳杆菌。 当海藻酸钠添加量为3%时，包埋的效果最好。 当海藻酸钠的浓度继续变大时，包埋效果不是太理想。

鼠李糖乳杆菌微胶囊的包埋率随明胶浓度的增大而升高，当明胶浓度为0.2%时，包埋率最为理想。 而明胶的浓度继续增高，形成强度大，在实际应用中包埋在微胶囊里面的菌种不能被释放出来，因此同样也会导致包埋率降低，包埋效果不理想。

通过微胶囊技术， 利用海藻酸钠和明胶进行复合包埋， 能够高效地包埋鼠李糖乳杆菌。 在本试验条件下包埋率达到（76.0±2.0）%。最后将制备的鼠李糖乳杆菌微胶囊应用于仔猪饲粮中， 研究其饲养效果。 相比未包被益生菌， 仔猪饲粮中添加包被益生菌（微囊化益生菌日粮）具有提高仔猪生长性能的趋势， 在一定程度上能提高仔猪的免疫性能。 通过给仔猪饲喂添加有益生菌制剂的日粮，导致仔猪的采食量增加，进而对其起到了促生长的作用。 这与Kantas 等（2015）研究结果一致。该复合益生菌制剂饲喂仔猪不但能提高其生长性能，还能提高其抗腹泻能力和其免疫能力，且饲喂添加量均以0.3%为最佳。

本试验研究的微胶囊， 不仅可以提高益生菌在动物饲料应用过程中的菌体存活率， 用以制备具有补充肠道益生菌的复合微胶囊，而且为益生菌微胶囊的工艺优化提供理论和实践依据， 具有极强的现实意义。