芹菜素激活TRAIL死亡受体参与诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的实验研究

2021-02-22崔昭阳李素娜姜旭倩王弈丹侯丽颖

癌变·畸变·突变 2021年1期

崔昭阳，李素娜，姜旭倩，王弈丹，侯丽颖，

(1．华北理工大学公共卫生学院，河北唐山063210；2．华北理工大学理学院，河北唐山063210)

胃癌是当今世界最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在诊断和治疗中存在早期不易发现、术后预后不良等难题，而且化疗药物容易产生毒副作用和耐药性，因此研发新的药物以寻求胃癌的有效治疗具有重要意义。芹菜素(apigenin，API)别名芹黄素，是一种从植物中提取的黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类及茶叶中，以芹菜中含量最高，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌以及抗病毒等药理作用。近年来已有大量研究显示API在多种肿瘤细胞系中均具有抗肿瘤作用，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和白血病等，API作为一种潜在的肿瘤化学预防、治疗剂已引起广泛的关注。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand，TRAIL)作为肿瘤坏死因子超家族成员之一，主要通过外源性信号通路参与肿瘤细胞凋亡的诱导。TRAIL与细胞膜上的死亡受体DR4、DR5特异性结合可将凋亡诱导信号传导至细胞内部引起后续的凋亡级联反应。本研究用中度分化的人胃癌SGC-7901细胞作为体外肿瘤模型，明确API对细胞增殖和凋亡的影响，进一步探讨TRAIL死亡受体是否参与了API诱导的细胞凋亡过程，旨在阐明API抗肿瘤作用的部分机制，为胃癌的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和药物处理

实验选用的人胃癌SGC-7901细胞来源于上海肿瘤研究所，保存在-80℃冰箱中。培养细胞使用含10%胎牛血清及1%青霉素、链霉素双抗的RPMI-1640完全培养液。于37℃、CO体积分数为5%的恒温培养箱中常规培养细胞，取对数生长期的细胞进行实验。

API用二甲基亚砜(DMSO)溶解成50 mmol/L的储备液，过滤除菌，4℃避光保存，使用时用含2%胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释至终浓度，0.1%DMSO处理组作为对照组。

1.2 主要试剂

API购自Sigma公司，CCK-8购自庄盟生物公司，FITC-Annexin V凋亡试剂盒购自BD公司，BCA蛋白定量试剂盒购自EpiZyme Scientific公司，抗兔DR4一抗购自Abcam公司，抗兔DR5一抗、β-actin一抗均购自Cell Signaling公司，抗兔碱性磷酸酶二抗购自PROMEGA公司，DR4 siRNA、DR5 siRNA均购自Santa Cruz公司。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖情况

取生长至对数期的人胃癌SGC-7901细胞，0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数板进行计数并用含2%胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释成细胞浓度为1×10个/mL的细胞悬液，于96孔板中按每孔100 μL进行铺板，待底面覆盖率达到70%～80%时，根据查阅文献以及前期预实验结果，设置不同浓度(20、40、60、80 μmol/L)API组、对照组(不含API的正常细胞孔)以及空白组(仅有培养液的无细胞孔)，分别作用细胞12、24、48 h，作用结束后各孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37℃避光孵育4 h，用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度

(450)值，按下式计算各组细胞增殖率。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

常规培养细胞，按照1×10个/孔的细胞浓度于6孔板中进行铺板，设置对照组及不同浓度(20、40、60、80 μmol/L)API组，根据前期预实验结果以及细胞增殖检测结果，选择作用细胞24 h；或在API作用细胞前，采用RNAi技术，使DR4 siRNA和DR5 siRNA转染SGC-7901细胞18 h，抑制DR4、DR5的表达，再加入60 μmol/L API作用细胞24 h，即设置对照组、API组、DR4 siRNA+API组、DR5 siRNA+API组，作用结束后分别收集各组细胞，缓冲液调整细胞浓度至1×10个/mL，取100 μL细胞悬液分别加入5 μL Annexin V-FITC和PI染料，混合后室温下避光孵育15 min，加入400 μL缓冲液静置5 min，流式细胞术分别检测各组细胞凋亡率。

1.5 Western blot检测DR4及DR5蛋白的表达水平

常规培养细胞，待培养皿底面覆盖率达到70%～80%时，设置对照组及不同浓度(20、40、60、80 μmol/L)API组作用细胞24 h，收集各组细胞，PBS冲洗离心取下层沉淀重悬于细胞裂解液中，超声破碎细胞，冰上裂解后离心取上清进行蛋白提取，BCA法测定蛋白含量，调整各组蛋白含量并与蛋白上样缓冲液混合，-20℃贮存备用。Western blot实验时取等量蛋白上样，用SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离，低温转移到PVDF膜，5%的牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1.5 h，置于DR4、DR5一抗中4℃摇晃孵育过夜，TBST清洗3次后再置于碱性磷酸酶二抗中37℃摇晃孵育1.5 h。采用增强化学发光法显色，数字成像仪对图像进行拍照及分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 芹菜素对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用

CCK-8法细胞增殖检测结果见图1，作用12 h，20、40、60、80 μmol/L API组细胞的增殖率依次为(82.87±0.46)%、(76.50±1.63)%、(60.69±0.98)%、(55.20±1.33)%(

=-0.99，

=860.52，

＜0.01)。作用24 h，各组细胞增殖率分别为(63.79±6.08)%、(39.70±4.98)%、(33.29±4.65)%、(37.61±3.62)%(

=-0.88，

=120.81，

＜0.01)。作用48 h，各组细胞增殖率分别为(55.08±3.24)%、(16.66±0.37)%、(8.63±0.90)%、(13.07±1.10)%(

=-0.89，

=1801.15，

＜0.01)。可见随着 API作用浓度的增加，细胞增殖率下降，作用12 h时在80 μmol/L处达到最大抑制率，作用24、48 h时均在60 μmol/L处达到最大抑制率，各组细胞增殖率与对照组相比差异均具有统计学意义(均为

＜0.01)，同时可以看出在相同的作用浓度下，细胞增殖率也随作用时间的增加而降低。

图1 不同浓度API作用SGC-7901细胞不同时间后的细胞增殖情况

2.2 芹菜素对人胃癌SGC-7901细胞的凋亡诱导作用

流式细胞术检测各组细胞凋亡情况的结果见图2，对照组和20、40、60、80 μmol/L API组细胞凋亡率依次为(0.87±0.64)%、(2.17±0.51)%、(23.30±5.63)%、(54.97±2.93)%、(60.57±1.64)%。各浓度组与对照组相比差异具有统计学意义(

=0.96，

=275.99，

＜0.05)，提示API可诱导人胃癌SGC-7901细胞发生凋亡，且随着作用浓度的增加，细胞凋亡率升高。

图2 API作用SGC-7901细胞24 h后的凋亡检测

2.3 芹菜素对人胃癌SGC-7901细胞TRAIL通路中死亡受体DR4、DR5蛋白表达的影响

Western blot检测TRAIL通路中死亡受体DR4、DR5蛋白表达的结果见图3。随着API作用浓度的增加，DR4和DR5的蛋白表达水平均呈现增加趋势，DR4蛋白表达水平在80 μmol/L处达到峰值，DR5蛋白表达水平在60 μmol/L处达到峰值。

2.4 芹菜素上调DR4、DR5表达对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响

DR4 siRNA和DR5 siRNA分别沉默DR4和DR5的表达后，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况的结果见图4，对照组、API组、DR4 siRNA+API组、DR5 siRNA+API组细胞凋亡率依次为(0.87±0.64)%、(54.97±2.93)%、(32.23±3.75)%、(29.53±0.93)%。结果表明阻断DR4、DR5的表达后，凋亡率与API组相比明显下降，各浓度组之间差异均具有统计学意义(

=246.763，

＜0.01)。

图3 Western blot检测API作用SGC-7901细胞后的DR4、DR5蛋白表达水平

图4 沉默死亡受体DR4和DR5后对API诱导SGC-7901细胞凋亡的检测

3 讨论

胃癌是一种源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤。据统计，2018年胃癌在全球的发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第2位和第5位，严重威胁了人民的生命健康。恶性肿瘤最基本的生物学特征是细胞的失控性增殖，而抑制肿瘤细胞增殖是API抗肿瘤作用的重要体现之一。本研究结果表明，随着API作用浓度的增加，细胞增殖率不断降低，作用12 h时在80 μmol/L处达到最大抑制率，作用24、48 h时均在60 μmol/L处达到最大抑制率，可见API能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，同时具有浓度依赖性。孙悦等使用MTT法观察了不同浓度API作用SGC-7901细胞24 h下的细胞增殖抑制情况，与本实验观察到的结果一致。刘欢等研究了 API低浓度(0～20 μmol/L)长时间(24～72 h)作用下对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用，本实验继续观察了高浓度(80 μmol/L)API在长时间的作用下对胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用，补充了API对胃癌细胞增殖抑制的实验，更加明确了API对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

促进肿瘤细胞凋亡是API抗肿瘤作用机制研究中的重要一环。细胞凋亡是一个由基因决定的细胞主动结束生命的过程，可以清除威胁机体稳态的细胞(如肿瘤细胞等)。在本研究中，我们用不同浓度API作用细胞24 h测定胃癌细胞凋亡率发现：随着API作用浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加，证明API可浓度依赖性的诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡。在一项对索拉非尼耐药的肝细胞癌的研究中，Şirin等首次发现在体外联合应用索拉非尼和API可明显增加肝癌细胞的凋亡，表明API在某些耐药细胞株中也有一定凋亡诱导作用。

在目前已知的细胞凋亡信号通路中，TRAIL通路属于死亡受体途径。TRAIL通路最显著的特征就是能够选择性杀伤肿瘤细胞而对大多数正常细胞无明显毒性。TRAIL通路之所以具有这种特征主要是因为TRAIL的一类特异性受体：死亡受体(death receptor，DR)，包括DR4和DR5，这类受体属于跨膜受体，在细胞内的部分含有死亡结构域(domain death，DD)功能区，与TRAIL特异性结合后就可传导凋亡信号引起细胞凋亡。同时在受体分布上，DR4和DR5在肿瘤细胞系中较为常见，因此在TRAIL通路中的DR4、DR5受体可以特异性的诱导肿瘤细胞凋亡。本研究通过Western blot检测了TRAIL通路中死亡受体DR4和DR5蛋白表达情况，发现随着API作用浓度的升高，DR4和DR5的蛋白表达量也逐渐增加，分别在API作用浓度为80和60 μmol/L处达到峰值，表明API可以上调TRAIL通路中死亡受体DR4和DR5的蛋白表达。已有研究表明在白血病细胞中发现API可通过上调TRAIL通路中死亡受体DR5的表达增强TRAIL诱导凋亡的作用，且这种作用在正常人外周血单核细胞中未观察到。Chen等发现在非小细胞癌中，API的存在也可同时上调死亡受体DR4和DR5的水平，并以p53依赖的方式使癌细胞对凋亡敏感。为了进一步明确DR4、DR5在API诱导的细胞凋亡中的作用，本研究用siRNA特异性沉默DR4、DR5受体，用60 μmol/L API作用细胞24 h测定凋亡率发现在沉默DR4和DR5受体后，与API组相比，DR4 siRNA+API组和DR5 siRNA+API组的细胞凋亡率均降低，因此本研究推测TRAIL通路中死亡受体DR4和DR5参与了API诱导人胃癌SGC-7901凋亡的过程。在一项关于培美曲塞诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的研究中同样发现了使用siRNA抑制DR5表达可以减弱培美曲塞对非小细胞肺癌细胞的凋亡诱导作用。

综上所述，本研究证实了API可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导其发生凋亡，诱导凋亡的机制可能与激活TRAIL通路中死亡受体DR4和DR5的表达有关。本研究进一步完善了API抗肿瘤作用的机制，为新的抗肿瘤靶点提供了更多的证据支持。