不同材料压舌板体外细胞毒性效应研究

罗 吉，陈小青，李 冰，马中春

(宁波海关技术中心，浙江 宁波 315100)

压舌板是一种常规的医用诊疗检查器具，已广泛应用于口腔及咽喉部常规检查及窒息抢救等专业领域。尤其是近年来，随着雾霾、呼吸道疾病增多，压舌板在呼吸道疾病检查中的应用也更为广泛。压舌板早期以铁质为主，虽也有不锈钢材质的，但如今以木制和竹制为最常见、常用，因为木制和竹制压舌板体现了一次性使用的卫生要求。但是，有关压舌板的毒理学安全性评价研究，尤其是体外细胞毒性效应研究却未见公开报道。笔者选用了分化能力较强，对生长环境要求较低，比较容易进行人工培养的L929细胞作为试验细胞，对3种材料的压舌板体外细胞毒性效应进行了评价，旨在为医疗器械检测提供必要的基础数据，为医疗器械生物学毒性评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

L929细胞株(小鼠成纤维细胞株)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 细胞培养

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的MEM培养液于37℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养。

1.1.3 主要试剂

胎牛血清，购于德国PAN公司；青链霉素混合液和0.25%胰蛋白酶，购于HyClone公司；MEM培养液，购于CORNING公司；异丙醇，购于上海国药；噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)，购于索莱宝公司。

1.1.4 受试物

木制压舌板，规格为150 mm×16mm，竹制压舌板，规格为150 mm×16 mm，不锈钢压舌板，规格为160 mm×19 mm，均购自当地市场。

1.2 方法

1.2.1 对照组设置

以含10%胎牛血清培养液为空白对照，含10%胎牛血清培养液浸提高密度聚乙烯所得浸提液为阴性对照，64 mg/mL苯酚溶液为阳性对照。

1.2.2 浸提液的制备

以含10%胎牛血清的MEM培养液为浸提介质，受试物表面积与培养基体积比为3cm：1 mL，在37℃下恒温振荡24 h。所得液体作为100%浸提原液，并稀释得到75%、50%、25%的浸提液。

1.2.3 染毒处理

L929细胞用0.25%胰酶(含EDTA)消化细胞制备成单细胞悬液，1 000 r/min离心3 min，然后将细胞重新分散于培养基中，调整细胞浓度为1×10个/mL，接种上述细胞悬液接种到96孔培养板中，每孔100 μL，置于37℃培养箱中(CO体积分数5%，湿度＞90%)培养24 h；待细胞长成单层后，吸出原来的培养液，分别加入100 μL不同浓度(25%、50%、75%、100%)的受试物浸提液、空白对照、阳性对照和阴性对照，37℃，CO体积分数5%条件下培养24 h。每组做5个平行样。

1.2.4 形态学观察

培养24 h后，取出96孔板在显微镜下观察细胞的圆缩、贴壁、溶解等状态。

1.2.5 MTT法检测细胞存活率

观察后，吸出原来的培养液，每孔加入1 mg/mL的MTT溶液50 μL，继续培养2 h，弃去MTT溶液，每孔加入100 μL异丙醇溶液。振荡平板，在570 nm处测量

D

(570)值(参照波长650 nm)，按下式计算细胞相对存活率。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26进行分析，各组间吸光度值比较采用单因素方差分析和

t

检验LSD法。

2 结果

2.1 形态学观察结果

空白对照组和阴性对照组细胞内颗粒明显，细胞无溶解，生长状态良好(图1A)；阳性对照组几乎所有细胞坏死(图1B)；100%木制压舌板浸提液组几乎所有细胞坏死(图1C)；75%浸提液组也是几乎所有细胞全部坏死；50%浸提液组圆缩、疏松贴壁及无胞内颗粒的细胞比例位于50%～70%；25%浸提液组圆缩、疏松贴壁及无胞内颗粒的细胞比例位于20%～50%。竹制压舌板各浓度组胞内颗粒明显，细胞无溶解，生长状态良好(图1D)。100%不锈钢压舌板浸提液组圆缩、疏松贴壁及无胞内颗粒的细胞比例小于20%(图1E)；其他各浓度组胞内颗粒明显，细胞无溶解，生长状态良好。根据GB/T 16886.5-2017中浸提液细胞毒性形态学定性评价标准，木制压舌板细胞毒性为4级，反应程度重度，有细胞毒性作用；竹制压舌板细胞毒性为0级，无细胞毒性作用；不锈钢压舌板细胞毒性为1级，反应程度轻微，无细胞毒性作用。

2.2 MTT实验检测结果

经MTT法所测阳性对照组和各剂量受试物浸提液组

D

(570)值均明显小于阴性对照组(见表1)，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)。计算得出100%木制压舌板浸提液的细胞相对存活率为20.1%，100%竹制压舌板浸提液的细胞相对存活率为89.1%；100%不锈钢压舌板浸提液的细胞相对存活率为81.2%。GB/T 16886.5-2017中提及，存活率较低时，试验样品潜在的细胞毒性较高，如存活率下降到小于空白的70%，则具有潜在的细胞毒性。木制压舌板的细胞存活率小于空白对照的70%，表明该受试物具有潜在的细胞毒性，竹制压舌板和不锈钢压舌板的细胞存活率大于空白对照的70%，表明这两种受试物不具有潜在的细胞毒性。

图1 各组细胞的形态学观察

表1 不同浓度的3种压舌板浸提液染毒后L929细胞相对存活率(MTT法)

3 讨论

医疗器械行业是知识密集、多学科交叉、竞争挑战激烈的高科技产业，是国家制造业和高科技尖端水平的标志之一。医疗器械是与人们生活密切、生命安全息息相关的特殊产品，压舌板则是其中广泛应用的基础产品。但是，有关压舌板的毒理学安全性评价研究尤其是体外细胞毒性效应却鲜有公开报道。笔者对3种材料的压舌板体外细胞毒性效应进行了评价，旨在为医疗器械检测提供必要的基础数据，为医疗器械生物学毒性评估提供理论依据。研究结果显示，100%木制压舌板浸提液组几乎所有细胞全部坏死，100%竹制压舌板浸提液组胞内颗粒明显，细胞无溶解，生长状态良好。100%不锈钢压舌板浸提液组圆缩、疏松贴壁及无胞内颗粒的细胞比例小于20%。经MTT法所测

D

(570)值计算得出100%木制压舌板浸提液的细胞存活率为20.1%；100%竹制压舌板浸提液的细胞存活率为89.1%；100%不锈钢压舌板浸提液的细胞存活率为81.2%。根据细胞毒性判定标准，木制压舌板对L929细胞有潜在细胞毒性，竹制压舌板和不锈钢压舌板无细胞毒性作用。考虑到压舌板制作过程中所使用的加工材料和原材料本身都可能会对细胞毒性的判定有影响。提示，不同材料的压舌板在细胞毒性上存在差异性，部分材料的压舌板具有细胞毒性或潜在细胞毒性，综合评价压舌板毒性应继续进行更为全面的毒理学研究。