年龄和性别对正常人外周血淋巴细胞核质桥自发率的影响

赵 骅，陆 雪，蔡恬静，田 梅，刘青杰

(中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，辐射防护与核应急中国疾病预防控制中心重点实验室，北京 100088)

人外周血胞质分裂阻滞(cytokinesis-block，CB)分析由Fenech等于1985年提出，可通过分析双核细胞中的微核(micronucleus，MN)、核质桥(nucleoplasmic bridge，NPB)及核芽(nuclear bud，NBD)检测染色体损伤，已逐渐应用于遗传毒性检测和职业人群的健康监测等领域。

核质桥是双核细胞两个主核间的桥状核质，是DNA错误修复、染色体重排和端粒融合的标志物。核质桥具有良好的剂量-效应关系，并有可能实现自动化分析，具有成为新的辐射生物剂量计的潜能。过往研究发现不同国家健康人群间核质桥自发率差异较大，且年龄和性别因素对其影响尚不明确。本研究选取了我国健康人群，采用胞质分裂阻滞法，分析了核质桥的自发率及年龄、性别对其的影响，为核质桥的影响因素研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

供血者为98位健康成人，无重大急慢性疾病史、无化学毒物接触史，采样前6个月内未受到过电离辐射，其中男性52例，女性46例，年龄范围为20～68岁，平均年龄为(40.7±12.6)岁。按年龄分为20～29岁组(22人)、30～39岁组(23人)、40～49岁组(25人)和50岁以上组(28人)。签署知情同意书后，抽取每名受试者外周血2 mL，注入肝素抗凝管。本研究通过中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所伦理委员会审查。

1.2 胞质分裂阻滞分析

将400 μL外周血加入到含有20%胎牛血清及0.2%植物凝血素(phytohemag-glutinin，PHA)的RPMI 1640培养基(2 mL)中，置于37℃温箱培养40 h后，加入终浓度为10 μg/mL的细胞松弛素B(cytochalasin-B，Cyt-B)，混匀后继续避光培养至68 h收获细胞。采用胞质分裂阻滞法进行低渗(0.075 mol/L KCI)、固定两次(

V

∶

V

=3∶1)、滴片、染色(Giemsa染液)。每名受试者外周血样本设2个平行样。

1.3 计数标准

光学显微镜放大400倍或1 000倍下，每个受试者观察1 000个双核细胞，计算核质桥、微核及核芽的发生率。计数标准参照Fenech等报道，其中双核细胞应具有两个独立且核膜完整的细胞核、两主核大小接近、与相邻细胞不可重叠；核质桥位于双核细胞中两个主核之间，宽度小于主核直径的1/4；微核是圆形或椭圆形且核膜完整的小核，直径为主核直径的1/16～1/3；核芽是与主核由核质连接的小核，连接宽度小于核芽直径。

1.4 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计学处理，不同组间核质桥率、微核率、核芽率的比较采用Mann-Whitney

U

检验，年龄、性别与核质桥、微核、核芽的相关性采用Spearman相关检验，年龄与微核的关系采用线性回归分析，以

P

＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 正常人群的核质桥自发率

本研究选取了98例正常个体，每位受试者分析1 000个双核细胞，其中54例(55.1%)未观察到核质桥，33例(33.7%)观察到1个核质桥，11例(11.2%)观察到2个核质桥。核质桥总体的自发率为(0.56±0.69)‰。男性核质桥自发率为(0.65±0.74)‰，女性核质桥自发率为(0.46±0.62)‰，核质桥自发率男性略高于女性，但差异并无统计学意义(

U

=1.32，

P

＞0.05，表1)。

表1 不同性别间核质桥、微核及核芽的自发率(±s)

男性和女性受试者不同年龄组的核质桥自发率见表2。结果表明，男性受试者在不同年龄组间，核质桥自发率差异无统计学意义(

U

＜1.49，

P

＞0.05)。女性受试者40～49岁组核质桥自发率最高，显著高于20～29岁组(

U

=2.31，

P

＜0.05)。相同年龄组的男性和女性核质桥自发率差异均无统计学意义(

U

＜1.41，

P

＞0.05)。

2.2 正常人群的微核及核芽自发率

98例样本中均观察到了微核，其中最少的观察到1个，最多的观察到52个，微核总体自发率为(13.10±10.65)‰。男性微核自发率为(11.57±8.10)‰，女性微核自发率为(14.82±12.82)‰，微核自发率女性高于男性，且差异具有统计学意义(

U

=4.40，

P

＜0.05，表1)。男性和女性受试者不同年龄组的微核自发率见表2。男性和女性受试者在20～29岁组至40～49岁组微核自发率呈上升趋势，男性50岁以上组稍有降低(

P

＞0.05)，女性50岁以上组显著低于40～49组(

U

＞2.23，

P

＜0.05)。男性20～29岁组微核率高于女性(

U

=4.25，

P

＜0.05)，而40～49岁组和50岁以上组微核率低于女性，差异具有统计学意义(

U

＞4.84，

P

＜0.05)。98例样本中，有26例(26.5%)未观察到核芽，其余样本中观察到1～9个核芽，核芽总体自发率为(2.02±2.08)‰。男性、女性核芽自发率分别为(2.19±2.09)‰和(1.82±2.08)‰，差异无统计学意义(

U

=1.28，

P

＞0.05，表1)。男性和女性受试者不同年龄组的核芽自发率见表2。男性受试者在不同年龄组间，核芽自发率差异无统计学意义(

U

＜1.76，

P

＞0.05)。女性受试者40～49岁组核芽自发率最高，为3.36‰，显著高于其余3组(

U

＞2.40，

P

＜0.05)。男性20～29岁组核芽自发率高于女性(

U

=3.57，

P

＜0.05)，其余3个年龄组，男性和女性核芽自发率差异均无统计学意义(

U

＜1.80，

P

＞0.05)。

表2 不同年龄组核质桥、微核及核芽的自发率(±s)

2.3 年龄、性别与核质桥、微核及核芽自发率的相关性

为探索年龄、性别与核质桥、微核、核芽自发率的相关性，对其进行了Spearman相关检验。结果表明，核质桥、核芽自发率与年龄、性别无明显的相关性，微核自发率与年龄、核质桥及核芽自发率具有一定的正相关性(表3)。进一步对年龄与微核自发率进行了线性回归分析，发现微核自发率具有随年龄增加而上升的趋势，在20～68岁间，年龄每增加1岁，微核自发率上升约为0.31‰。

表3 年龄、性别与核质桥、微核及核芽自发率的相关系数

3 讨论

理想的生物剂量计，在具有良好剂量-效应关系和较强辐射敏感性的同时，还应在正常人群中具有较低的自发率，不受性别和年龄的影响，或与其具有明确的变化规律。染色体畸变分析是目前辐射生物剂量估算的金标准，主要分析指标是双着丝粒染色体，已在国内外多次应用。研究表明，核质桥源于双着丝粒染色体，因此，核质桥也有可能成为新的辐射生物剂量计。在相同的培养条件下，核质桥与双着丝粒的发生率具有正相关性。双着丝粒染色体的本底自发率很低，而受到电离辐射后则会出现较高的发生率。因此，探索核质桥的自发率及其在不同性别、年龄人群中的变化规律，对其成为辐射生物剂量计具有重要意义。

本研究发现核质桥在正常人群的自发率很低(0.56‰)，与双着丝粒染色体接近(0.58‰)，远低于微核自发率(13.10‰)和核芽自发率(2.02‰)。本研究核质桥自发率与Coskun等对土耳其人群(0.61‰)及Zijno等对意大利人群(0.61‰)的研究结果相近；高于Lope等对西班牙人群的报道，低于Cho等对韩国人群、Donmez-Altuntas等对土耳其人群、Nefic等对波黑人群及Garaj-Vrhovac等对克罗地亚人群的研究结果。不同报道中核质桥自发率差异较大，可能是由于不同种族之间的差异，也可能是年龄、性别不同或核质桥的判定标准不同所致。因此，应明确不同人群的核质桥自发率，确定核质桥在人群中的正常值区间，降低遗传因素导致的本底水平的不稳定性，从而有效应对个体辐射暴露的筛查和生物剂量的评估。

过往研究表明，年龄、性别是影响核质桥自发率的重要因素，但在对不同国家健康人群的报道中结果不尽相同。本研究中，男性总体核质桥自发率略高于女性，但差异并无统计学意义(

P

＞0.05)；相同年龄组男性与女性的核质桥自发率差异也无统计学意义(

P

＞0.05)，与过往报道结果一致。但也有研究表明，男性核质桥自发率显著高于女性，或者显著低于女性。本研究中相关性检验结果表明，核质桥与年龄并无明显相关关系。按不同年龄分组后，男性和女性核质桥自发率在20～29岁组至40～49岁组随年龄的增加而增加，而50岁及以上组反而降低。可能与总体样本量较少有关，下一步还将扩大样本量，进一步证实本研究结果。有研究结果表明，年龄与核质桥自发率具有相关性。因此，性别、年龄因素对核质桥自发率的影响尚需更多的研究。此外，还有研究报道了吸烟、不良生活方式也可影响核质桥的自发率，因此今后的研究还将关注这些因素。本研究还分析了微核及核芽的自发率。微核总体自发率为13.10‰，属于健康人群正常的自发率水平，但高于部分报道的健康人群微核率的自发率，可能是与本研究受试者的平均年龄较大(40.7岁)有关。微核自发率女性高于男性，核芽自发率在男性和女性之间差异无统计学意义(

P

＞0.05)。微核在男性和女性的不同年龄组中，差异均有统计学意义(

P

＜0.05)，而核芽仅在女性的不同年龄组中差异具有统计学意义(

P

＜0.05)。微核自发率存在性别差异在过往研究中已有报道，Mateuca等研究表明，微核自发率在健康人群中随年龄增长有所升高，女性微核自发率高于男性，可能与X染色体形成的微核或X染色体缺失有关。年龄增长可导致DNA修复效率下降以及基因突变增多，从而引起DNA损伤增加，进而导致染色体损伤的频率升高[24]。

综上所述，本研究采用胞质分裂阻滞法，发现我国健康人群中的核质桥自发率较低，不受性别因素影响，在20～49岁范围内具有随年龄增加而升高的趋势，为核质桥的影响因素研究提供了科学依据。