漆姑草醇提物对白血病细胞K562的诱导分化作用

伏 琼，唐文娟，程 勇，贺仁政，梁 冰，2，

(1．贵州医科大学药理学教研室，贵州 贵阳550025；2．贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

白血病全世界每年新发病例约30万，死亡率高达70%，在我国死亡率是3.86/10万，其中儿童所占比率日益增加，严重威胁着人类健康。白血病是多因素、多基因，多分子机制参与的血液系统恶性肿瘤，其进展快，常规治疗手段有联合化疗、基因治疗、免疫治疗等，预后差。诱导分化治疗白血病不直接杀伤白血病细胞，而是诱导白血病细胞分化为正常细胞或接近正常细胞，逐渐成为白血病治疗的主要治疗策略之一。大量天然药物及其成分对白血病细胞的诱导分化作用的研究，让从中草药中开发高效低毒的分化诱导剂成为白血病治疗的热点。漆姑草味苦，性凉，生于阴湿处，为石竹科植物漆姑草的全草，民间治疗白血病效果明确。本实验通过漆姑草醇提物(

Herba Saginae Japonicae

，HSJ)对慢性粒细胞性白血病细胞(K562)的作用，探讨HSJ对白血病细胞诱导分化的机制，拟为漆姑草对白血病的治疗作用阐明理论依据，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

TS-100-F倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；Elx 800UV酶联免疫检测仪(美国Bio-Tek公司)；BD FACSCantoⅡ Flow Cytometer 338960流式细胞仪(美国Becton Dikson公司)；凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。

漆姑草全草，购于贵阳市药材市场，经贵州医科大学龙庆德教授鉴定；台盼蓝、四甲基噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、1640 培养基及双抗(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，美国Merck公司)；硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium bluechloride， NBT， 美 国 Sigma-Aldrich公司)；佛波酯(phorbol ester，TPA，浙江联科生物有限公司)；瑞氏、吉姆萨粉剂(北京索莱宝科技有限公司)；异硫氰酸荧光素标记的粒细胞单克隆抗体(fluorescein isothiocyanate-CD14，FITC-CD14)、别藻蓝蛋白标记的粒细胞单克隆抗体(allophycocyanin-CD11b，APC-CD11b)、藻红蛋白标记的巨噬细胞单克隆抗体(p-phycoerythin-CD42，PE-CD42)和藻红蛋白标记的巨核细胞单克隆抗体(p-phycoerythin-CD41a，PE-CD41a)均为美国BD公司产品；珠蛋白转录因子1(globin transcription factor 1，GATA-1)抗体、造血转录因子1(hematopoietic transcription factor，PU.1)抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗人单克隆抗体为武汉三鹰生物技术有限公司产品；羊抗兔IgG-HRP(美国Santa Cruz公司)。

1.2 漆姑草醇提物制备

漆姑草全草50 g用70%乙醇，50℃水浴提取4 h，趁热过滤，减压浓缩，得HSJ干浸膏，制备20 mg/mL的母液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，-20℃贮存备用。

1.3 分组与处理

K562细胞(源自中国科学院上海细胞库)置于含有10%胎牛血清的1640培养基中，于37℃、CO体积分数为5%饱和湿度的恒温培养箱中培养。于96孔板中按1×10个/mL接种对数生长期的K562细胞悬液，培养24 h后，设HSJ高、中、低浓度(分别为250、125、62.5 μg/mL)3个实验组和阴性对照组(等体积1640培养基)，每组3个复孔，继续培养48 h。

1.4 指标与方法

1.4.1 细胞增殖抑制率检测

采用MTT法，收集细胞，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，培养箱孵育4 h后，3 000 r/min离心15 min，弃上清。每孔加入200 μL DMSO，振荡溶解结晶，酶标仪测定吸光度

D

(490)值，取平均值计算药物对细胞生长的抑制率。

1.4.2 NBT还原实验

收集细胞，离心弃上清，沉淀加1 mg/mL的NBT 200 μL和100 μg/mL的佛波酯10 μL混匀，37℃避光温育1 h，离心弃上清，每个样本分别涂片3次，光学显微镜下随机计数200个细胞，计数阳性细胞数(胞质内含有灰蓝颗粒为阳性细胞)，取平均值计算NBT还原率。

1.4.3 细胞形态观察

采用瑞氏-吉姆萨染色法，收集细胞悬液，PBS洗涤1次，离心弃上清，沉淀加100 μL PBS重悬后涂片，加甲醇固定10 min，双蒸水冲洗3 min，晾干，加瑞氏-吉姆萨染色工作液(瑞氏-吉姆萨染色原液∶PBS=1∶9，

V/V

)染色30 min，自来水冲洗3 min，晾干，倒置显微镜观察细胞形态并拍照。

1.4.4 分化相关抗原 CD11b、CD14、CD41a、CD42b表达阳性细胞检测

采用流式细胞术，收集细胞，用预冷PBS洗2次，将细胞分至A、B两只流式管，A管加APC-CD11b单克隆抗体3 μL、FITCCD14单克隆抗体5 μL、PE-CD41a单克隆抗体5 μL混匀；B管加PE-CD42b单克隆抗体5 μL混匀，室温避光静置孵育15 min，PBS洗涤1次，重新加PBS到流式管刻度线处，吹打均匀，通过流式细胞仪检测CD11b、CD14、CD41a和CD42b的荧光强度，分析分化相关抗原CD11b、CD14、CD41a和CD42b阳性细胞的表达率。

1.4.5 K562细胞GATA-1和PU.1蛋白表达检测

采用Western blot法，收集细胞，用预冷PBS洗涤1次，加裂解液(细胞裂解液∶蛋白酶抑制剂=99∶1，

V

/

V

)，冰上裂解15 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量后制样，煮沸5 min。以12%的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，湿电转移法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下封闭1.5 h后加入适当浓度的一抗(GATA-1单抗1∶1 000稀释，PU.1单抗1∶500稀释，内参照GAPDH单抗为1∶5 000稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗稀释液(1∶10 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，化学发光法显色，暗室曝光、显影、定影，扫描灰度值进行统计分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 漆姑草对K562细胞增殖的影响

经不同浓度HSJ作用48 h后，K562细胞增殖能力受到不同程度抑制(

P

＜0.05)，随着浓度的增加K562细胞增殖抑制率增加，见表1。

表1 HSJ对K562细胞增殖抑制率和NBT还原能力的影响(±s，n=3)

2.2 漆姑草对K562细胞NBT还原能力的影响

与对照组相比，250、125、62.5 μg/mL HSJ组K562细胞的NBT还原率均升高，差异均有统计学意义(

P

＜0.05)，见表1。

2.3 漆姑草对K562细胞形态的影响

阴性对照组细胞的胞核呈圆形，结构完整，核浆比例较大；经不同浓度HSJ处理后，细胞核浆比例减小，出现分叶状细胞核，两叶、三叶或者多叶，部分细胞核凹陷出现明显的细胞分化状态，随着给药浓度的增加细胞核缩小程度越大，分化细胞越多，见图1。

图1 漆姑草对K562细胞形态的影响

2.4 漆姑草对K562细胞分化相关抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b表达的影响

与阴性对照组比较，经不同浓度HSJ作用后，K562细胞分化相关抗原CD11b、CD14、CD41a和CD42b阳性表达率均不同程度升高，差异均具有统计学意义(

P

＜0.05)，见表2和图2。

表2 HSJ对分化相关抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b阳性表达率的影响(±s，%)

2.5 漆姑草对K562细胞GATA-1和PU.1蛋白表达的影响

与阴性对照组比较，经不同浓度HSJ作用48 h后，GATA-1和PU.1蛋白表达水平均增加，差异均有统计学意义(

P

＜0.05)，见图3、表3。

图2 漆姑草对K562细胞分化相关抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b表达的影响

图3 HSJ对K562细胞GATA-1和PU.1蛋白表达的影响

表3 HSJ对K562细胞GATA-1和PU.1蛋白表达水平的影响

3 讨论

白血病是造血系统恶性克隆性疾病，骨髓造血干细胞失去分化成熟的能力而停滞在幼稚阶段，大量原始与早期幼稚血细胞急剧增生直接释放到血液中，被称为“液体肿瘤”，浸润其他脏器组织，正常的造血功能被抑制，其治疗可采用放疗、化疗和骨髓移植等。K562细胞为慢性粒细胞白血病细胞，在K562细胞向红系、粒系、巨核系细胞方向分化时，K562细胞的形态、功能、分化相关抗原和蛋白表达均会发生一系列变化。中药具有高效低毒、资源丰富、标本兼治的特点，且具有治疗效果温和、不良反应小等优点，故从其中寻找诱导分化剂已成为白血病诱导分化治疗的热点之一。漆姑草民间用于白血病的治疗，疗效确切，但其治疗白血病的机制研究较少，本文以K562细胞为实验对象，探讨漆姑草醇提取物对K562细胞的分化诱导作用，并分析其诱导分化的作用机制。

白血病细胞持续分裂和不断增殖是癌细胞的一个重要特征，细胞的分化成熟度与细胞增殖能力呈负相关，即细胞分化越成熟，其生长能力越弱，因此药物对肿瘤细胞的增殖抑制能力，是其分化的一个重要标志。本研究结果显示，不同浓度HSJ对K562细胞增殖能力具有抑制作用；K562细胞经250、125、62.5 μg/mL HSJ作用48 h后，细胞向成熟方向改变并出现明显的分化形态；在佛波酯的激发下，成熟度较高的细胞内超氧阴离子产生增多，可将水溶性淡黄色的活性染料NBT还原为不溶性蓝黑色颗粒-甲臜。NBT还原实验显示，与阴性对照组相比，NBT阳性细胞明显增多，K562细胞功能趋近成熟。采用瑞氏-吉姆萨染色法，细胞包浆呈蓝色，细胞核呈蓝紫色，从形态学的角度直观观察，给药组K562细胞核直径变小，出现明显的分叶现象，两叶、三叶或者多叶，核浆比例减少，核仁减少或消失，核染色质浓缩，胞浆丰富，出现明显的分化形态。白血病细胞与正常造血干、祖细胞一样，在分化成熟过程中细胞表面的抗原标志不断发生变化，在获得一些新抗原的同时也丢失了某些原有的抗原。因此，不同的分化抗原可作为细胞分化各个阶段的表面标志，根据分化抗原表达可较精确判断细胞所处的分化阶段。成熟粒系细胞分化的标志CD11b、单核细胞标志抗原CD14、巨噬细胞表面分化抗原CD41a、巨核细胞分化抗原CD42b，流式细胞术检测分化相关抗原阳性表达率可以反映细胞的分化方向及阶段。本研究结果显示，与阴性对照组相比，不同浓度HSJ作用K562细胞48 h后，CD14、CD11b、CD41a和CD42b阳性表达率均增加(

P

＜0.05)。GATA结构是其他红系非珠蛋白基因的启动子或增强子活化所必需的，被称为红系特异转录因子的

GATA-1

基因主要调控红系和巨核系的发育，而在粒系、单核系的成熟过程中则受抑制；PU.1是从原癌基因

SpI-1

的产物中分离出的一种新的蛋白因子，不在红系和T细胞表达，但促进白血病细胞向髓系方向发育。在本次实验中我们发现GATA-1蛋白、PU.1蛋白表达增加，提示HSJ能诱导K562细胞向成熟粒细胞、单核细胞、巨核细胞和红细胞方向分化。

本研究从细胞的形态、功能、分化相关抗原及蛋白表达等方面证实HSJ能诱导K562细胞向成熟细胞方向分化，结合临床成熟分化诱导剂，存在不同程度的毒副作用，且单用复发率相当高，临床耐药病例日渐增多的现状，开发高效低毒的天然分化诱导剂治疗白血病，成为研究热点，漆姑草作为民间治疗白血病的天然药物，其诱导分化能力被进一步证实，但诱导分化的机制还不是很明确，为了更好的开发利用漆姑草资源，其分化诱导的机制有待进一步深入研究。