亚砷酸As(Ⅲ)诱导人肺癌A549细胞氧化应激反应的实验研究

赵俊伟，华辰凤，尚平平，谢复炜，李 翔

(中国烟草总公司郑州烟草研究院烟草化学重点实验室，河南 郑州 450001)

砷是一种广泛存在于自然界的微量元素，被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)确定为I类致癌物。烟草制品中的砷及砷化合物也被美国食品和药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)列为致癌、致瘾和致呼吸毒性的物质。人体砷的暴露途径有多种，例如水和食物的摄取、含砷粉尘吸入等，吸烟也是一种砷的暴露途径。研究表明，卷烟烟气中的砷，主要以无机状态存在，亚砷酸As(Ⅲ)是烟草中砷化合物之一。氧化应激是体内氧化和抗氧化失衡的一种状态，被认为是导致人体衰老和形成各种疾病的早期事件。研究显示，卷烟烟气中的氧化性物质能够诱导细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，对细胞内蛋白质、脂质和DNA等造成损伤。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是体内清除自由基的首要物质，有助于保护细胞免受损伤。肺是卷烟烟气接触的主要靶器官，A549细胞源于人肺泡细胞癌，该细胞既有肿瘤细胞的特性，又有肺泡上皮细胞的表型，因此常被用于卷烟烟气的体外毒性研究。本研究选取SOD和ROS作为亚砷酸As(Ⅲ)诱导细胞发生氧化应激反应的指标，通过检测亚砷酸As(Ⅲ)溶液在不同染毒浓度下SOD和ROS水平的变化，分析亚砷酸As(Ⅲ)诱导的细胞氧化损伤，旨在为研究亚砷酸As(Ⅲ)诱导的氧化应激反应提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

A549细胞，购于上海生命科学院细胞资源中心；RPMI-1640基础培养基、胎牛血清，购于美国GIBCO公司；Cu/Zn-SOD ELISA试剂盒，购于美国Ebioscience公司。活性氧检测试剂盒，购于上海碧云天生物技术有限公司；亚砷酸As(Ⅲ)溶液标准物质，购于中国计量科学研究院。HERA Cell 240 CO细胞培养箱和SW-CJ-2FD超净工作台，均购于苏州安泰空气技术有限公司；SPECTRA MAX 190酶标仪，购于美国Molecular Devices公司；荧光/化学发光检测仪，购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞培养

以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基培养A549细胞，置于37℃、CO体积分数为5%的细胞培养箱中培养，隔天换一次培养基，待细胞进入对数生长期，用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 CCK-8法检测细胞存活率

取对数生长期的细胞，胰酶消化后，以1.5×10个/孔的浓度接种至96孔板中，于37℃、CO体积分数为5%的培养箱内培养24 h，移去培养基进行染毒。分别设置空白组(含10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基)、阴性对照组(A549细胞和RPMI-1640培养基)和染毒组[亚砷酸As(Ⅲ)溶液以砷浓度计分别为2.5、5、10、20 μg/mL，下文中关于亚砷酸As(Ⅲ)溶液的浓度均按此计]，每个剂量设6个平行孔，培养24 h后，加入10 μL的CCK-8，培养2 h后，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度值

D

(450)，按下式计算各浓度的细胞存活率。

进行3次独立实验。选择细胞存活率超过80%的浓度，即亚砷酸As(Ⅲ)溶液的浓度分别为2.5和5 μg/mL，作为检测细胞培养液中SOD浓度和细胞内ROS含量的浓度。

1.2.3 细胞培养液中SOD浓度检测

将A549细胞接种于96孔板中，于37℃，CO体积分数为5%的培养箱内培养24 h，移去培养基，进行染毒。分别设对照组(含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基)和暴露组[亚砷酸As(Ⅲ)溶液的浓度为2.5、5 μg/mL]，每个浓度设4个平行孔，置于细胞培养箱内孵育24 h。收集的细胞培养液样品，按照Cu/Zn-SOD ELISA试剂盒的操作步骤检测细胞培养液中的SOD。即洗涤液清洗抗体包被板2次，然后每孔加入100 μL样品，并加入辣根过氧化酶同源物稀释剂50 μL，于室温下密封振荡1h；洗涤3次，每孔加入基质溶液100 μL，室温下避光振荡10 min；每孔加入100 μL的终止液，酶标仪检测吸光度值

D

(450)。梯度稀释标准品，绘制标准曲线，根据标准品的浓度和对应的吸光度值

D

(450)，计算出标准曲线的直线回归方程，采用回归方程计算各组的SOD浓度。

1.2.4 细胞内ROS含量检测

细胞染毒和剂量选择同1.2.3。染毒结束后，弃细胞培养液，每孔加入50μL用无血清培养基稀释的浓度为10 μmol/L的荧光探针DCFH-DA。置于细胞培养箱内培养20 min。无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以去除未进入细胞的DCFH-DA，之后每孔加入50 μL的无血清培养基，用荧光/化学发光检测仪检测荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。以相对荧光强度代表细胞内ROS含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度亚砷酸As(Ⅲ)溶液处理后A549细胞存活率比较

亚砷酸As(Ⅲ)溶液对A549细胞存活率的影响见图1。0、2.5、5、10和20 μg/mL的亚砷酸As(Ⅲ)溶液染毒A549细胞24 h后，细胞存活率分别为(100±10)%、(86±5)%、(81±8)%、(45±6)%和(5±1)%，总体差异有统计学意义(

F

=182.298，

P

＜0.01)，进行两两比较结果显示，亚砷酸As(Ⅲ)溶液(浓度为2.5、5、10和20 μg/mL)染毒的细胞存活率均低于对照组(

t

=2.398、3.471、11.024、22.044，均为

P

＜0.05)。随着亚砷酸As(Ⅲ)溶液染毒剂量的升高，A549细胞的存活率呈逐渐降低的趋势(

r

=0.99，

P

＜0.05)。A549细胞暴露于亚砷酸As(Ⅲ)溶液24 h的IC为8.8 μg/mL。

图1 亚砷酸As(Ⅲ)溶液对A549细胞存活率的影响

2.2 细胞培养液中SOD浓度比较

亚砷酸As(Ⅲ)溶液对A549细胞培养液中SOD浓度的影响结果见表1。亚砷酸As(Ⅲ)溶液的浓度为0、2.5和5 μg/mL时，A549细胞培养液中SOD浓度的差异有统计学意义(

F

=23.429，

P

＜0.05)；进行两两比较结果显示，亚砷酸As(Ⅲ)溶液的浓度为2.5和5 μg/mL时SOD浓度均高于对照组(

t

值分别为-4.910和-5.640，均为

P

＜0.05)，亚砷酸As(Ⅲ)溶液的浓度为5 μg/mL时SOD浓度高于剂量为2.5 μg/mL组(

t

=-3.911，

P

＜0.01)。

2.3 细胞内ROS含量比较

亚砷酸As(Ⅲ)溶液对A549细胞内ROS含量(相对荧光强度)的影响结果见表1。与对照组比较，亚砷酸As(Ⅲ)溶液的剂量为2.5和5 μg/mL时，A549细胞内ROS含量均较高，差异有统计学意义(

F

=640.039，

P

＜0.05)；与阴性对照相比，亚砷酸As(Ⅲ)溶液的浓度为2.5和5 μg/mL时细胞内ROS含量均高于对照组(

t

=-17.811，-58.765，均为

P

＜0.01)，亚砷酸As(Ⅲ)溶液的剂量为5 μg/mL组的细胞内ROS含量高于剂量为2.5 μg/mL组(

t

=-15.473，

P

＜0.01)。

表1 亚砷酸As(Ⅲ)溶液对A549细胞培养液中SOD和细胞内ROS浓度的影响(n=4，±s)

3 讨论

本研究结果显示，一定浓度的亚砷酸As(Ⅲ)溶液能显著降低A549细胞的存活率，且随着染毒浓度的升高，存活率呈逐渐降低的趋势。A549细胞暴露于亚砷酸 As(Ⅲ)溶液 24 h 的 IC为 8.8 μg/mL(约 11.76 μmol/L)。既往研究显示，亚砷酸As(Ⅲ)溶液对人源性肝QSG7701细胞、人皮肤成纤维CCC-ESF-1细胞，人支气管细胞和人舌鳞癌Tca8113细胞等均具有体外细胞毒性，IC值分别为170.89、16.52、32和288.40 μmol/L。这些文献和本实验结果表明，亚砷酸As(Ⅲ)对多种脏器来源的细胞均具有体外细胞毒性，但毒性作用强弱存在一定差异，这可能是由于细胞种属、实验条件、染毒时间和观察方法等不尽相同所致。

ROS是细胞氧化代谢的产物，细胞发生氧化应激时，细胞内ROS生成增多，过量的ROS参与继发性细胞氧化损伤和凋亡过程。本研究结果显示，亚砷酸As(Ⅲ)溶液染毒A549细胞24 h后，能够诱导细胞内ROS表达，尤其是在2.5 μg/mL染毒时即可导致ROS增加，表明较低剂量的亚砷酸As(Ⅲ)溶液可造成细胞氧化损伤，这与王跃武等的实验结果相一致。本实验结果显示，5 μg/mL的亚砷酸As(Ⅲ)溶液染毒细胞时，ROS相对荧光强度为(242.60±2.35)%，高于2.5 μg/mL的亚砷酸As(Ⅲ)溶液染毒细胞产生的ROS，表明亚砷酸As(Ⅲ)染毒浓度增大，细胞内ROS增加越明显，亚砷酸As(Ⅲ)的细胞毒性也越大，提示亚砷酸As(Ⅲ)诱导细胞内的氧化损伤可能是引起A549细胞毒性的原因，这有待进一步研究证实。

在本研究中，亚砷酸As(Ⅲ)溶液浓度为2.5和5 μg/mL时，A549细胞的SOD浓度均高于对照组，且5 μg/mL染毒细胞产生的SOD高于2.5 μg/mL组，这可能是由于在正常状态下，SOD是维持自由基动态平衡的重要抗氧化酶之一，但亚砷酸As(Ⅲ)染毒细胞后，破坏了细胞抗氧化系统的平衡，为清除过多的自由基，使SOD代偿性地升高。有研究显示，亚砷酸As(Ⅲ)染毒人皮肤成纤维CCC-ESF-1细胞后，随着染毒浓度升高，SOD表达降低，在本实验的检测浓度范围内，SOD并未降低，部分原因可能是测试SOD的细胞染毒浓度的不同造成的。在该研究中用于测试SOD的最大染毒剂量的细胞存活率为(13.8±2.9)%，而本研究选取存活率超过80%的剂量进行染毒[存活率为(81±8)%]，提示在低剂量染毒时(存活率超过80%)，SOD浓度升高，而高剂量时降低，这仍需进一步验证。

综上所述，浓度为0～20 μg/mL的亚砷酸As(Ⅲ)溶液染毒A549细胞，细胞存活率降低，且具有剂量依赖关系，表明亚砷酸As(Ⅲ)具有明显的细胞毒性。随着亚砷酸As(Ⅲ)溶液染毒浓度的增加，ROS和SOD浓度均升高，造成不同程度的氧化损伤，具体机制有待于进一步深入探讨。