镁合金生物材料的生物相容性研究

张聪正 梁晨 梁婷 孙雪函 郝书鹏

摘要：目的 评价羟基磷灰石（HA）涂层镁铝合金（AZ31B）的体外生物相容性。 方法 实验分为3组：HA涂层AZ31B浸提液组（H组）、阳性对照组（P组）和空白对照组（N组）。将L929细胞与各组混合液培养3、5和7 d，采用WST-1法检测细胞活力并进行细胞毒性分级。各组混合液与稀释兔血混匀，测定吸光度（OD）并计算溶血率。采用各组混合液对白化豚鼠分别进行皮内诱导、局部诱导和激发，观察去除贴敷片24、48、72 h动物激发部位皮肤情况。 结果 3、5和7 d N组和H组细胞毒性反应分级为0级，P组部分细胞毒性反应分级为3级;各时间点 H 组、N 组细胞活力均高于 P 组，差异有统计学意义（P <0.05）。H 组、P 组和 N 组 OD 值分别为（0.004 ±0.001）、（0.648 ± 0.050）和（0.008 ± 0.003）;H组溶血率为—0.6%，无溶血反应。去除貼敷片24、48、72 h H组皮肤无明显改变，P组可见中度至重度融合性红斑。 结论 体外实验提示HA涂层镁铝合金具有良好的体外生物相容性。

关键词：镁;铝;合金;羟基磷灰石类;骨代用品;生物相容性材料;组织相容性实验

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂和材料

酶标仪（澳大利亚，Biocell公司），Du530分光光度计（美国，Beckman 公司）;CO2培养箱（美国，Thermo Scientific公司）;高糖DMEM培养液、优等胎牛血清、胰蛋白酶（美国，Hyclone公司），WST-1（上海碧云天生物技术有限公司），草酸钾（广州化学试剂厂），二甲基亚砜（DMSO）、完全氟氏佐剂（美国，Sigma 公司）;HA 涂层镁铝合金（AZ31B）。

圆盘型样品，直径10 mm、厚3 mm（中国科学院金属所提供）;小鼠成纤维细胞L929（广州军区广州总医院医学实验科细胞库提供）。

1.2 实验动物

新鲜抗凝兔血取自新西兰大白兔[广东省医学实验动物中心提供，SCXK（粤）2008-0002]，白化豚鼠购自广东省实验动物中心[SCXK（粤）2008-0002]。

1.3 细胞毒性实验

分别于培养3、5、7 d取各组6孔观察细胞形态，按细胞毒性反应分级标准判定毒性分级。培养板内每孔加入10 μL WST-1溶液后置于摇床上摇动 1 min，37 ℃培养箱内继续孵育2 h。采用酶标仪在420和620 nm下测量吸光度（optical density，OD）值，检测细胞活力。

1.4 溶血实验

实验分为 HA 涂层 AZ31B 浸提液实验组（H组）、蒸馏水阳性对照组（P组）以及生理盐水阴性对照组（N组）。各组平行操作3个样本。其中H组将 HA 涂层 AZ31B 样品完全浸泡于生理盐水（浓度为0.9%）中，37 ℃恒愠水浴保持30 min。取0.1 mL草酸钾溶液（浓度为20 g/L）加入干燥管中。取新西兰白大白兔血2 mL加入干燥管，2.5 mL生理盐水（浓度为0.9%）稀释。AZ31B浸提液、蒸馏水、生理盐水（各 2 mL）中分别加入 0.02 mL 稀释兔血，混匀后37℃水浴继续保温60 min，取出后以 1 000 r/min 离心 5 min。比色皿中移入各组上清液，分光光度计于545 nm波长处测定OD值。

实验样品溶血率按以下公式计算：实验样品溶血率 =（实验组OD值—阴性对照组OD值）（阳/性对照组OD值—阴性对照组OD值）。阴性对照组的OD值不应大于0.03，阳性对照组的OD值应在0.5～1.0之间。

1.5 统计学分析

应用 SPSS 18.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x- ± s）表示，多组细胞毒性实验OD 值的比较采用Factorial ANOVA分析，组间两两比较采用 S-N-K 法;多组溶血试验 OD 值的比较采用One-way ANOVA。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞毒性实验

培养3、5、7 d N组和H组细胞贴壁生长良好，无细胞悬浮，毒性反应分级为0级;P组部分细胞呈悬浮状态，细胞量较少，毒性反应分级为3级。N组和H组培养3 d细胞密度较低，细胞伸展良好，呈长梭形或多边形;培养5 d细胞密度增加，细胞间较为拥挤，绝大部分细胞伸展良好，呈长梭形或多边形，部分细胞因细胞密度增加而形成圆形;培养7 d细胞密度极高，细胞间极其拥挤，出现分层现象，细胞难以伸展，细胞形态变小，出现大量圆形细胞。

H组和N组各观察期OD值均较P组为高，差异有统计学意义（P <0.05）;H组和N组随时间推移细胞活力逐渐增大，5 d时达到最高峰后开始下降（P <0.05）。

2.2 溶血试验

N 组、P 组平均 OD 值分别为（0.008 ± 0.003）和（0.648 ± 0.050），本组实验有效;H组溶血率为—0.6%，无溶血反应。

3 讨论

镁合金具有与人体相匹配的力学特性，以及其它金属所不具有的可降解性，可望成为一种新型骨科植入材料。我们既往的实验研究结果证实，无涂层镁铝合金具有严重的溶血反应，本实验结果显示HA涂层镁铝合金溶血率为—0.6%，无溶血反应。

孟祥翔等报道，表面进行阶跃式阳极氧化改性后的镁合金 （AZ-1 和 AZ-3）材料溶血率<5%，具有良好的血液相容性;郭磊等对氧化镁表面膜处理的AZ31B镁合金材料进行安全性评价，结果显示，与AZ31B镁材料较高的溶血率相比，经氧化镁表面膜处理的AZ31B镁合金材料其溶血率符合生物材料标准，表明涂层处理可大大减少镁合金的溶血作用。

尽管我们的既往研究提示镁铝合金无皮肤致敏作用，但毕竟涂层改变了镁铝合金的性状，因此我们对HA涂层镁铝合金作了进一步的皮肤致敏实验，结果显示豚鼠皮肤无明显改变，该涂层材料无致敏作用。

参考文献：

[1] 刘魁， 郭磊， 黄晶晶， 等. AZ31B镁合金植入小鼠的生物相容性考察[J] . 中国生物工程杂志， 2008， 28（3）： 59-63.

[2] 陈旭琼， 尹庆水， 张余， 等. 镁合金材料的溶血率及影响因素[J] . 中国组织工程研究， 2012， 16（25）： 4632-4636.

课题项目：

1、河南省科技攻关项目，项目编号：192102210162;

2、河南省高等学校重点科研项目，项目编号：21A4300 28。