基于网络药理学探讨黄芪治疗病毒性心肌炎的作用机制

陈品良 陈汉裕 陈梓欣 冼绍祥

摘要 目的：基于網络药理学对黄芪治疗病毒性心肌炎（VMC）的作用机制进行探讨。方法：在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）获取并筛选黄芪活性成分，获得对应的靶蛋白，并用Uniprot数据库将蛋白名称校正为基因符号，通过GeneCards、OMIM数据库筛选出VMC的相关基因，将黄芪的靶基因与VMC相关基因取交集获得黄芪治疗VMC的靶基因，使用Cytoscape 3.8.0构建“黄芪-活性成分-靶基因-VMC”网络，在STRING数据库下载PPI数据并利用R 4.0.0筛选出核心靶基因，利用R 4.0.0对黄芪治疗VMC的靶基因进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。结果：共获得黄芪活性成分20个，靶基因191个，VMC相关基因192个，取交集获得黄芪治疗VMC的靶基因34个，构建“黄芪-活性成分-靶基因-VMC”网络，VEGFA、AKT1、IL10、IL6、MMP9、TNF等可能是黄芪治疗VMC的核心靶基因。GO富集主要集中于细胞因子受体结合、细胞黏附的调节、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞因子活性等方面。KEGG通路富集在AGE-RAGE信号通路（糖尿病并发症中）、IL17信号通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路、查加斯病通路等。结论：本研究初步揭示了黄芪治疗VMC的核心靶基因和涉及的生物学过程及信号通路，为后续深入研究提供一定参考。

关键词 黄芪;病毒性心肌炎;靶基因;网络药理学;作用机制;活性成分;基因本体富集;京都基因和基因组百科全书通路富集

Investigation of Mechanisms of Radix Astragali seu Hedysari in the Treatment of Viral Myocarditis Based on a Network Pharmacology Approach

CHEN Pinliang1，CHEN Hanyu2，CHEN Zixin2，XIAN Shaoxiang2

（1 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2 The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Abstract Objective：To investigate the mechanisms of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of viral myocarditis （VMC） based on a network pharmacology approach.Methods：Radix Astragali seu Hedysari′active ingredients were obtained from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）.The corresponding target proteins of active ingredients were obtained from TCMSP，and the protein names were corrected to gene symbols by using UniProt database.We obtained the related genes of VMC in GeneCards and OMIM database.The target genes of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC were obtained by the intersection of the target genes of Radix Astragali seu Hedysari and the related genes of VMC.Using Cytoscape 3.8.0“Radix Astragali seu Hedysari-Active ingredient-Target gene-VMC” network was constructed.The PPI data were downloaded from STRING database and the core target genes were obtained through screening in R 4.0.0.R 4.0.0 was used to perform Go and KEGG pathway enrichment analysis on the target genes of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC.Results：A total of 20 active ingredients and 191 target genes of Radix Astragali seu Hedysari were obtained while 192 related genes of VMC were obtained.A total of 34 target genes of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC were obtained by intersection.The“Radix Astragali seu Hedysari-Active ingredient-Target gene-VMC” network was constructed.VEGFA，AKT1，IL10，IL6，MMP9，TNF，etc.may be the core target genes for Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC.The enrichment of GO is mainly concentrated in the cytokine receptor binding，regulation of cell-cell adhesion，response to lipopolysaccharide，response to molecule of bacterial origin，cytokine activity，etc..The enrichment of KEGG pathway was mainly concentrated in the AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，IL-17 signaling pathway，Hepatitis B，Influenza A，Chagas disease （American trypanosomiasis），etc.Conclusion：This study preliminarily reveals the core target genes，biological process and signal pathway of Radix Astragali seu Hedysari in the treatment of VMC，which provides reference for further research.

Keywords Radix Astragali seu Hedysari; Viral myocarditis; Target gene;Network pharmacology; Mechanism; Active ingredient; GO enrichment; KEGG pathway enrichment

中图分类号：R289.5;R735.7;R541文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.015

病毒性心肌炎（Viral Myocarditis，VMC）是由病毒感染所致的弥漫性或局限性心肌炎症性疾病，以儿童和40岁以下的成年人居多，大多数患者可自愈，但其中一些可以迁延并发生各种心律失常，还有一些可以急性发作，导致心力衰竭，甚至猝死。目前VMC无特异性治疗，主要是给予抗病毒、促心肌代谢、生命支持及对症治疗等处理，但存在治疗时间长、效果欠佳、易反复等不足。

中医临床常常重用黄芪参与治疗VMC，以汤剂或成药（如黄芪颗粒、黄芪口服液等）口服，或制成针剂，疗效显著，也有不少相关文献报道，但其作用机制尚未完全阐明。鉴于中药具有多成分、多靶点等特点，本研究基于网络药理学的相关原理及研究方法，分析黄芪治疗VMC的活性成分、靶基因及相关信号通路，探讨其中可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 获取并筛选黄芪活性成分，获得对应的靶基因

采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），检索“黄芪”，筛选条件设置为：口服生物利用度（OB）>30%，类药性（DL）>0.18，获得黄芪活性成分及对应的靶蛋白;考虑到该平台对蛋白质命名不规范，于是使用UniProt数据库，以“Human”“Reviewed”作为过滤条件，将蛋白名称校正为基因符号，得到黄芪的靶基因。

1.2 筛选VMC相關基因

在GeneCards数据库与OMIM数据库检索“viral myocarditis”，对结果进行筛选并去重，得到VMC相关基因。

1.3 获得黄芪治疗VMC的靶基因

利用R 4.0.0对1.1与1.2获得的基因取交集，即获得黄芪治疗VMC的靶基因。

1.4 构建“黄芪-活性成分-靶基因-VMC”网络

创建“黄芪-活性成分”“活性成分-靶基因”“VMC-靶基因”关系文件和属性文件，利用Cytoscape 3.8.0构建“黄芪-活性成分-靶基因-VMC”网络。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选核心靶基因

在STRING数据库上传1.3获得的基因，筛选条件为种属选择人，最小互作分数值为0.400，得到靶基因相应蛋白的PPI网络。下载PPI数据（TSV文件），利用R 4.0.0计算筛选出PPI网络的核心蛋白，相应的基因即是核心靶基因。

1.6 基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

在R 4.0.0安装并运行Bioconductor软件包“org.Hs.eg.db”，将黄芪治疗VMC的靶基因符号转换成Entrez Gene ID。然后在R 4.0.0安装Bioconductor软件包“clusterProfiler”[1]，根据已转换的Entrez Gene ID，以P<0.05，Q<0.05进行GO与KEGG通路富集分析，并分别按校正后P从小到大对其排列顺序，选择前20个，绘制条形图。

2 结果

2.1 获取并筛选黄芪活性成分，获得对应的靶基因  获取87个黄芪的化学成分，得到20个黄芪活性成分，其对应的靶蛋白校正后获得靶基因191个。见表1。

2.2 筛选VMC相关基因

在GeneCards数据库检索到847个VMC相关基因，以Score≥10筛选，获得139个相关基因;从OMIM数据库得到62个VMC相关基因;筛重后获得VMC相关基因192个。

2.3 获得黄芪治疗VMC的靶基因

191个黄芪的靶基因与192个VMC相关基因取交集得到34个交集基因，即为黄芪治疗VMC的靶基因。见图1。

2.4 构建“黄芪-活性成分-靶基因-VMC”网络

经统计，34个黄芪治疗VMC的靶基因对应着黄芪的6个活性成分，分别是槲皮素、异鼠李素、山柰酚、刺芒柄花素、毛蕊异黄酮、7-O-methylisomucronulatol，构建“黄芪-活性成分-靶基因-VMC”网络。蓝色长方形代表VMC，红色八边形代表黄芪，黄色菱形代表黄芪的活性成分，绿色圆形代表黄芪治疗VMC的靶基因，灰色连线代表各节点间相互关系。见图2。

2.5 构建PPI网络并筛选核心靶基因

获得黄芪治疗VMC的靶基因相应PPI网络见图3，无游离蛋白，456条边代表了蛋白之间的相互作用。得到PPI网络核心蛋白的条图见图4。左列为蛋白符号，数字为相应蛋白邻接节点数目。蛋白相应基因即是核心靶基因，按蛋白邻接节点数目由多到少依次为VEGFA、AKT1、IL10、IL6、MMP9、TNF等。

2.6 GO富集分析

黄芪治疗VMC的靶基因富集到的生物学过程与功能有1 938个。见图5。左字母为GO名称，条形图代表富集在GO上的基因，图下数字为富集在GO上的基因数，P代表富集的显著性，颜色越红代表富集程度越高。黄芪治疗VMC的靶基因的GO富集主要涉及：细胞因子受体结合、细胞黏附的调节、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞因子活性、白细胞-细胞黏附的调节、白细胞-细胞黏附、T细胞活化、细胞黏附的正向调节、细胞间黏附的正向调节、白细胞-细胞黏附的阳性调节、外源性凋亡信号通路、T细胞活化的调节、细胞对生物刺激的反应、细胞因子产生的正调控、脂多糖的细胞反应、受体配体活性、细菌源性分子的细胞反应、活性氧代谢过程的正调控、对抗生素的反应等。

2.7 KEGG通路富集分析

黄芪治疗VMC的靶基因富集到的通路有134条。见图6。左字母为KEGG名称，条形图代表富集在KEGG上的基因，图下数字表示富集在KEGG上的基因数，P表示富集的显著性，颜色越红则富集程度越高。黄芪治疗VMC的靶基因，主要涉及下列KEGG通路：AGE-RAGE信号通路（糖尿病并发症中）、IL-17信号通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路、查加斯病（美国锥虫病）通路、人巨细胞病毒感染通路、肿瘤坏死因子信号途径、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、疟疾通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、肺结核通路、丙型肝炎通路、炎症性肠病通路、麻疹通路、Toll样受体信号通路、胰腺癌通路、利什曼病通路、弓形虫病通路、EB病毒感染通路、膀胱癌通路等。

3 讨论

VMC当属于中医学“心悸”“胸痹”等范畴，病机为正虚邪侵，而以正虚为本，临床常见气短乏力、心悸怔忡、口干咽燥等症状。黄芪气温，味甘平，为补药之长，能补虚扶正，正存邪去。

本研究发现，黄芪治疗VMC的主要活性成分槲皮素、异鼠李素、山柰酚、刺芒柄花素、毛蕊异黄酮、7-O-methylisomucronulatol都属于黄芪的黄酮类成分[2]。有研究表明，槲皮素可减轻柯萨奇病毒B3（CVB3）诱导的新生小鼠VMC氧化应激损伤和炎症反应，可增强超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）和乳酸脱氢酶（LDH）水平，抑制IL-1β、IL-6和iNOS分泌，减弱TGF-β1、p-核因子κB P65和TNF-α表达[3]。异鼠李素也有明显的抗氧化活性[4]。凋亡是VMC细胞死亡的主要机制之一[5]，山柰酚可明显改善LPS引起的大鼠心肌H9c2细胞活性降低，减少凋亡的发生[6]。目前尚未见刺芒柄花素、毛蕊异黄酮及7-O-methylisomucronulatol作用于VMC的相关报道，但在构建的“黄芪-活性成分-靶基因-VMC”网络中，这三者都与MAPK14相关联。MAPK14的表达异常可以导致免疫功能失调及生理功能紊乱，主要涉及应激条件下引起的凋亡与炎症反应[7]。因此推测刺芒柄花素、毛蕊异黄酮及7-O-methylisomucronulatol可能通过抗炎、调节免疫及减少凋亡等作用治疗VMC，这值得进一步研究。

在PPI网络核心蛋白对应的核心靶基因中，VEGFA、AKT1、IL10、IL6、MMP9、TNF位于核心位置。VEGFA（也称为VEGF）编码VEGF，研究显示，感染CVB3所致VMC的BALB/c小鼠心肌组织VEGF mRNA表达较正常组高，且在感染病毒后表达渐增高，14 d达最高峰，且VEGF mRNA表达与心肌病理损害程度密切相关[8]。AKT1编码的AKT1，是AKT激酶家族3种亚型之一，PI3K/AKT通路被证实是控制心肌细胞成活和功能的、最重要的促增殖及抗凋亡信号通路之一[9]。IL10、IL6分别编码IL10、IL6，研究发现，感染CVB3的BALB/c小鼠，在2～4周内心肌组织产生的IL6及IL10 mRNA在各时期的表达量均显著高于对照组，在0～6周各时期中的血浆IL-6及IL-10蛋白水平均显著高于对照组相应时期[10]。MMP9编码MMP9，研究显示，小鼠心肌的MMP9在VMC早期就表达增高，MMP9可能通过介导Ⅰ型胶原的降解代谢来参与VMC的病理过程，是导致VMC胶原重构及心肌纤维化的重要因素之一[11]。TNF编码TNF，TNF曾分为α和β2种，TNF-α即经典的TNF，研究显示，VMC小鼠TNF-α水平升高，并与心肌病理损害程度密切相关，降低血清TNF-α水平，可能是黄芪治疗VMC的作用机制之一[12]。

黄芪治疗VMC靶基因的GO富集集中于：细胞黏附的调节、白细胞-细胞黏附的调节、白细胞-细胞黏附、细胞黏附的正向调节等细胞黏附相关功能;细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性等分子功能;对脂多糖的反应、细胞对生物刺激的反应、脂多糖的细胞反应等细胞反应相关功能;T细胞活化、T细胞活化的调节等T细胞活化相关功能。提示黄芪治疗VMC的靶基因可能通过影响这些生物学过程来促进VMC的好转。

黄芪治疗VMC靶基因的KEGG通路富集集中在乙型肝炎、甲型流感、人巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、麻疹、丙型肝炎、EB病毒感染、查加斯病（美國锥虫病）、疟疾、利什曼病、弓形虫病、肺结核、炎症性肠病、Toll样受体等相关信号通路上，这些富集信息与微生物感染、炎症反应及免疫因素相关，由此推测，黄芪可能是通过抑制病毒、减轻炎症反应以及调节免疫功能来治疗VMC。

马恒等[13]研究证实了AGE-RAGE可导致的糖尿病心肌功能障碍，这提示VMC的心功能障碍可能与AGE-RAGE信号通路激活有关。研究发现，IL-17在小鼠VMC的发病机制中起重要作用，用抗IL-17中和IL-17可改善临床症状，延缓病情，降低血清IL-17水平;VMC患者IL-17水平明显高于正常水平，经积极治疗见效后，IL-17水平明显降低;这些均表明IL-17信号通路在VMC的进展中起重要作用[14-15]。临床研究发现，与健康儿童比较，VMC患儿外周血TNF-α的蛋白水平及mRNA表达水平明显升高[16-17]，提示TNF-α参与VMC的发病过程，而黄芪颗粒联合常规治疗在明显提高疗效的同时，可明显降低血清中TNF-α水平（比常规治疗显著）。研究表明，VMC患者血管内皮依赖性舒张功能受损明显，而层流剪切应力诱导的NO生成在内皮功能和血管内稳态中起着关键作用，当归补血汤对低流体剪切应力作用下的内皮细胞功能损伤具有一定的保护作用，且在黄芪占比增大时，保护效应更显著[18-20]。

本研究也存在一些不足，首先，由于有筛选条件限制，不能纳入所有的化学成分，且可能存在尚未发现或鉴定的化学成分。例如，黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ）是黄芪的皂苷类成分之一，目前已有不少关于口服黄芪甲苷治疗CMV的实验研究报道，已证实其有抗VMC的作用，但由于黄芪甲苷OB值只有22.50%，类药性值只有0.15，没达到筛选标准，且在TCMSP中又无相应预测靶蛋白，因此未囊括在本研究中。其次，基于网络药理学可得到黄芪活性成分与靶基因的相关性，但不能明确具体调控关系。另外，由于未考虑中药在体内的复杂代谢过程，使得研究预测的结果具有一定的局限性。因此，要证实网络预测的结果，还需要进行进一步的实验研究。

综上所述，黄芪是通过多成分、多靶点、多通路来治疗VMC的，本研究初步揭示了黄芪治疗VMC的核心靶基因和涉及的生物学过程及信号通路，为后续深入研究提供一定参考。另外，本研究还发现刺芒柄花素、毛蕊异黄酮、7-O-methylisomucronulatol有潜在治疗VMC的作用，值得進一步实验研究。

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（2020-11-10收稿 责任编辑：杨觉雄）