转移性结直肠癌患者外周血及肿瘤组织RAS 基因突变一致性对西妥昔单抗治疗疗效的影响*

王永洪 王健 贺万斌 付榆 但杰 朱明杰

（四川省乐山市人民医院 乐山 614000）

结直肠癌（CRC）是常见的胃肠道恶性肿瘤之一，发病早期临床症状缺乏典型性，具有发病率高、致死率高等特点[1]。目前，临床上治疗CRC 以手术切除根治为主，虽然能切除病灶组织，但是30%以上患者确诊时已经发生转移，即发展为转移性结直肠癌（mCRC）（肝脏是CRC 血行转移主要靶器官），mCRC 成为我国居民死亡的重要原因。mCRC 治疗中，借助单克隆抗体西妥昔单抗或帕尼单抗能竞争性阻断表皮生长因子（EGF）和其他配体的结合，抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞凋亡[2]。循环游离DNA（cfDNA）是一种天然存在于血细胞中的物质，且越来越多的研究证实，实体瘤的基因突变可能是由携带循环肿瘤DNA 的癌症细胞进入血浆引起。本研究以mCRC 患者为研究对象，探讨mCRC 患者外周血及肿瘤组织RAS 基因突变一致性对西妥昔单抗治疗疗效的影响。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017 年5 月～2018 年12 月收治的mCRC 患者69 例作为研究对象，男37 例，女32 例，年龄20～84 岁，平均（57.85±5.79）岁；原发肿瘤部位：左半结直肠51 例，右半结肠18 例；转移类型：同时性48 例，异时性21 例；腹膜转移：有9例，无60 例。纳入标准：（1）符合mCRC 诊断标准，均经病理学、影像学检查确诊；（2）肿瘤原发灶及转移灶部位明确；（3）均处于姑息性一线或二线化疗；（4）具备一个可用的mCRC 用于肿瘤组织突变分析诊断。排除标准：（1）精神异常、凝血功能异常或认知功能异常者；（2）血液系统疾病、严重肝肾功能异常或伴有自身免疫系统疾病者。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 所有患者的肿瘤组织均采用石蜡包埋进行常规处理，肿瘤组织区域的选择由病理学专家评估。同时应考虑肿瘤组织标准化所需样本量。外周血血浆和血液中制备标本如下：入组患者借助DETA 管采集血浆10 ml，60 min 离心，采用两步血液离心操作进行10 min 离心，速度1 600 rpm，操作完毕后采集上清；将剩余的细胞在室温下完成10 min 离心，速度3 000 rpm，血浆上清转移到EP 管1.5 ml 中，储存在-80℃冰箱中，备用。所有患者肿瘤组织经石蜡包埋后进行突变分析，并由医院病理科专家评估、确认肿瘤细胞数；10 μm 切片制备前，56℃下利用二甲苯、乙醇提取物对脱蜡面积＞15%肿瘤组织进行过夜，并给予蛋白酶K 消化。

1.2.2 RAS 基因突变分析 采用放射免疫法和实时荧光定量PCR 技术对血浆和肿瘤组织进行RAS状态检测。从mCRC 患者中的组织中提取DNA，并完成相关检测；采用放射免疫法评估RAS 基因突变情况。当检测结果不一致时，可查询历史RAS 检测报告，若组织可用，再转移时利用SOC 技术再次完成RAS 基因检测。（1）DNA 纯化。借助循环核酸试剂盒完成DNA 的提取、纯化。采用DNA 纯化试剂盒完成FFPE 样品提取与自动化系统maxwell16 FFPE 浓度测定。采用Nanodrop 1000 分光光度仪完成DNA 浓度提取。（2）肿瘤组织中ctDNA 的BEAMing 技术。从2 ml 血浆中获得检测样本，利用oncobeam RAS CR 检测试剂盒检测。利用流式细胞仪获得的数据通过FCS Express TM 软件进行分析；突变率＞0.02%～0.04%的样品为阳性。采用荧光标记探针完成敏感基因位点的检测，并利用流式细胞仪获得实时荧光定量（PCR）相关产物，采用FCS Express 软件比较突变体与野生型等位基因的比例；突变率在1%以上为阳性[3]。

1.2.3 实时荧光定量PCR 技术检测 （1）总RNA的提取。向样品中加入200 μl 氯仿，15 s 振荡后进行15 min 离心，速度4 500 rpm。离心完毕后去除上清，加入预冷乙醇1 ml，常温下干燥7 min；在A260吸光值下完成总RNA 测定。（2）检测。采用PCR 法测定RAS 基因突变位点，50 ng 的DNA 被用于外部引物扩增，95℃下连续完成14 个循环，每个循环30 s，根据相应的温度下进行30 s 退火，最后在72℃下完成RT-PCR 反应扩增30 s。扩增的DNA 作为PCR 模板，点突变分析的引物用于探针的检测[4]。

1.2.4 治疗方法及RAS 基因对疗效的影响 患者均采用西妥昔单抗治疗，初始剂量西妥昔单抗注射液（注册证号S20130004）400 mg/m2，静脉滴注，之后每周用药250 mg/m2，每4 天重复给药。疗程结束后完成30 个月随访。

1.3 统计学分析 采用SPSS24.0 软件处理，计数资料行χ2检验，采用%表示，计量资料行t检验，采用（）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mCRC 患者RAS 基因突变检测分析 69 例mCRC 患者均完成RAS 基因突变检测，结果表明：患者中RAS 基因突变26 例，RAS 基因野生型患者17 例，占65.38%，突变型患者9 例，占34.62%。其中，12 号密码子GGT 突变为GTT 10 例，突变为GAT 8 例；突变为AGT、CGT、TGT、GCT 患者1 例；13 号密码子GGC 突变为GAC 3 例，突变为TCG 4例。见图1。

图1 mCRC 患者RAS 基因突变位点

2.2 mCRC 患者外周血及肿瘤组织中RAS 基因突变一致性分析 所有患者均完成外周血及组织中RAS 基因突变检测，结果表明：mCRC 患者组织中RAS 基因突变检出率高于外周血中（P＜0.05）。见表1。

表1 mCRC 患者外周血及肿瘤组织中RAS 基因突变一致性分析

2.3 不同RAS 基因突变类型mCRC 患者西妥昔单抗疗效分析 对所有mCRC 患者均常规给予西妥昔单抗治疗，并对患者进行30 个月随访，结果表明：mCRC 患者中野生型患者利用西妥昔单抗后患者平均生存期为（21.49±5.64）个月，长于突变型患者的（16.23±3.59）个月（P＜0.05）。见图2。

图2 不同RAS 基因突变类型mCRC 患者西妥昔单抗生存期比较

3 讨论

肿瘤细胞内信号传导是一个相对复杂的网络，RAS 基因则是表皮生长因子受体（EGFR）依赖的下游信号转导通路Ras-Raf-MAPK 途径的重要基因。国内学者研究表明，所有mCRC 患者均应进行KARS 基因状态检测，且只有KRAS 野生型患者临床建议接受EGFR 抑制剂治疗[5]。肿瘤细胞发生凋亡时常伴有遗传物质的释放，造成血中存在游离的肿瘤DNA，且与原发肿瘤遗传信息相同。同时，RAS基因的测定以外周血、组织测定为主，但是临床上对其一致性存在争议。本研究中，患者中RAS 基因突变26 例，RAS 基因野生型患者17 例，占65.38%，突变型患者9 例，占34.62%。其中，12 号密码子GGT突变为GTT 10 例，突变为GAT 8 例；突变为AGT、CGT、TGT、GCT 1 例；13 号 密码子GGC 突变为GAC 3 例，突变为TCG 4 例，说明RAS 基因在mCRC 患者中突变率较高，且突变类型较多，均会增加临床诊疗难度。循环肿瘤DNA 主要源于肿瘤细胞自主分泌、坏死及凋亡后的DNA 片段，其片段上常携带突变信息。本研究中，mCRC 患者组织中RAS 基因突变检出率高于外周血中（P＜0.05），可以看出mCRC 患者病灶组织中RAS 基因突变率高于外周血中，对于难以获得结直肠癌组织或耐药突变人群，可测定外周血中循环肿瘤DNA[6]。西妥昔单抗属于一种针对EGFR 的人鼠嵌合单克隆抗体，主要由鼠的抗EGFR 抗体可变区和人的IgG1 重链与κ 轻链的恒定区组成，药物与EGFR 具有较强的亲和力，能阻断EGF、EGFR 结合，引起下游酪氨酸激酶活性降低，阻止肿瘤生长，发挥肿瘤细胞杀伤作用。本研究结果说明mCRC 患者外周血及肿瘤组织RAS 基因突变类型会对西妥昔单抗治疗效果产生影响，治疗前应加强患者RAS 基因测定，制定详细的治疗方案，使得患者的治疗更具科学性。

综上所述，mCRC 患者外周血及肿瘤组织RAS基因突变存在一定的差异，会对患者西妥昔单抗治疗疗效产生一定影响，应根据RAS 基因突变类型制定针对性治疗方案，提高治疗疗程。