山芹菜中总黄酮的提取工艺优化

杨宇婷

（吉林农业大学，吉林长春 130000）

山芹菜的根呈圆锥形，有分支，黄褐色，为伞形科大叶芹属植物[1-2]。山芹菜可用作食用也可用作药膳。山芹菜外皮呈紫红色，表面有比较深的纹络，主要在5—6月份采集[3]，其根部较粗壮，茎部相对短，须根暗褐色。山芹菜益处极多，味道甘凉且具有调经消炎，降压镇热和清热止咳等功效，可清理胃中湿浊[4-5]。山芹菜同时具有清热、利水消肿、止血止带[6-7]、降血压、降血糖、抗炎、抗动脉硬化等重要的药用价值[8]。

自21世纪以来，总黄酮一直备受人们关注与研究，人们发现其具有维生素C样的活性[9]，研究发现，总黄酮均有不同程度的抗氧化作用，总黄酮在某种程度上也具有清除自由基等生物性高活性[10]。在营养学和科学界备受关注。总黄酮有2-苯基色原酮结构使其具有多种生物活性[11]，可抗衰老等[12]。总黄酮其抗氧化性主要体现在减少自由基和清除自由基，山芹菜中的总黄酮成分有利于自身营养需求的选择。本实验通过改变提取过程中的参数使其得率提高，为山芹菜资源的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山芹菜，来自吉林省双阳区郊区；芦丁标准品纯度，上海岚派生物技术有限公司；无水乙醇，陕西西安天茂化工有限公司；亚硝酸钠，天津市鼎盛鑫化工有限公司；硝酸铝，广州省广州市锦源化学有限公司；甲醇，广州省广州市锦源化学有限公司；氢氧化钠，陕西省西安天茂化工有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（型号：JY5002，上海沪瑞明仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（型号：HH-6，常州朗越仪器制造有限公司）；粉碎机（型号：M150A，中山市雕牌电器有限公司）；超声波清洗机（型号：SB-800D，宁波新芝生物科技有限公司）；循环式水式多用真空泵（型号：SHB-III，郑州长城科工贸有限公司）；紫外分光光度计（型号：UV-1240，上海岛津实验器材有限公司）；恒温干燥箱（型号：GZX-9146MB，上海博迅科技有限公司）

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

山芹菜中总黄酮的提取工艺流程见图1。

图1 工艺流程图

1.3.2 操作要点

①山芹菜的选取。选取新鲜，无虫蛀、无损坏的山芹菜的茎叶进行研究。②烘干。采用电热鼓风干燥箱105 ℃干燥。③总黄酮的提取。取烘干后的山芹菜，用粉碎机粉碎后过100目筛，然后称取山芹菜的粉末2 g放于烧杯内，同时加入40 mL左右的合适浓度乙醇，进行浸提。超声功率选择100 W，处理一段时间，处理完成后用布氏漏斗对其进行抽滤2次，合并抽滤液，再用与浸提乙醇浓度相同的乙醇稀释至刻度15 mL，得到样品液，备用。

1.3.3 山芹菜中总黄酮提取量的测定及得率计算

（1）绘制芦丁标准曲线。称量2 mg芦丁放到烧杯中备用，保证芦丁干燥，加入浓度70%的乙醇对芦丁进行溶解，定容至10 mL，得到0.2 mg/mL的芦丁标准液。吸取0 mL、0.50 mL、1.50 mL、2.00 mL和2.50 mL的芦丁标准液，加入0.3 mL 5%的亚硝酸钠，摇匀后放置6 min；加入4%的氢氧化钠溶液6 mL，静置10 min；加入10%的硝酸铝0.3 mL，静置6 min，加乙醇稀释至刻度。乙醇作为空白试剂，在510 nm处测量吸光度，得到回归方程。

（2）总黄酮得率的计算。取山芹菜样品稀释液照上述方法操作，对山芹菜提取液进行吸光度测试[9]，代入式（1），计算得山芹菜黄酮得率[10]。

式中：C为山芹菜总黄酮提取样品的质量浓度，mg/mL；V为山芹菜总黄酮样液的总体积，mL；M为山芹菜质量，g。

1.4 单因素实验

在控制其他因素不变的前提下，分别设置乙醇浓度梯度（50%、60%、70%、80%和90%）、料液比梯度（1∶5、1∶10、1∶ 15、1∶ 20和1∶25）、超声温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃ 和 80 ℃）、 超 声 时 间（40 min、50 min、60 min、70 min和80 min）进行单因素试验，测定山芹菜样液样品吸光度值，计算山芹菜总黄酮样品总黄酮得率。

1.5 正交实验设计

在单因素实验结果基础上，通过正交试验不断地改进提取工艺，以乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间等4个变量为主要的实验因素[11-12]，进行4因素3水平正交实验。以山芹菜总黄酮提取率进行判断，从而确定最佳的提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

由图2可知，横坐标表示样品的吸光度值，纵坐标表示溶液浓度，得到芦丁标准曲线，回归方程为：Y=0.349 2x+0.007，R2=0.996 4

图2 芦丁标准曲线

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 不同乙醇浓度对山芹菜总黄酮得率的影响

由图3可知，当乙醇浓度在50%～70%时，山芹菜总黄酮得率呈增长趋势，当乙醇浓度达到70%时，可以看出此时总黄酮得率最大，乙醇的浓度过高则会破坏提取液中溶质细胞壁，超过70%即实验山芹菜总黄酮得率呈下降趋势。因此最佳的乙醇的浓度应为60%、70%、80%作为正交实验3个水平。

图3 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

2.2.2 不同料液比对山芹菜总黄酮得率的影响

由图4可知，当料液比在1∶5～1∶15时，山芹菜的总黄酮得率呈上升趋势，当料液比在1∶15时达到最大值，当料液比＞1∶15时山芹菜总黄酮得率逐渐下降，所以选择1∶10、1∶15、1∶20这3个料液比作为最佳的正交试验水平。

图4 料液比对总黄酮得率的影响

2.2.3 超声温度对山芹菜总黄酮得率的影响

由图5可知，当温度在40～60 ℃时，山芹菜总黄酮得率呈上升趋势，这表明在这个温度区间内，温度越高，总黄酮的得率越大。但当超声温度超过60 ℃时，山芹菜总黄酮得率不再增加且出现下降的现象，随着温度的不断增大，有大分子的物质溶解出来，故而生物的活性成分会遭受到破坏。故选择50 ℃、60 ℃、70 ℃这3个超声温度作为正交实验3个水平。

图5 提取温度对总黄酮得率的影响

2.2.4 超声时间对山芹菜总黄酮得率的影响

由图6可知，当超声时间在30～70 min时，山芹菜总黄酮得率呈上升趋势，但超过70 min后可以看出总黄酮的得率开始下降。而随着提取时间的延长，不断地有一些杂质溶出，影响实验结果。所以应选择60 min、70 min、80 min这3个最佳超声时间作为正交实验3个水平。

图6 超声时间对总黄酮得率的影响

2.3 正交试验结果分析

在单因素实验的基础上进行正交实验，选择乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度4个因素，正交试验因素水平见表1，正交试验结果见表2。山芹菜总黄酮化合物得率的影响因素大小关系B＞C＞A＞D，本研究的提取条件是：A1B2C2D2，与K、k最优组合A2B2C2D2不符合，对此进行验证性实验。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果表

2.4 验证性实验及结果分析

正交试验中结果显示山芹菜的总黄酮得率最高实验组与K值分析的实验组不同，故对正交试验中A1B2C2D2和A2B2C2D2进行验证性实验。A2B2C2D2所测得山芹菜总黄酮的得率最高，最优的料液比为1∶15，超声温度60 ℃、70%浓度的乙醇、70 min的提取时间，最佳工艺条件下，山芹菜总黄酮得率1.368%。

3 结论

本实验研究了超声波辅助法对于山芹菜中总黄酮提取的优化方案，实验采用了单因素和正交，最终确定的最优条件是：以70%浓度的乙醇作为提取剂、料液比1∶15（g∶mL）、超声温度60 ℃、超声时间70 min，得到总黄酮得率为1.368%。