HPLC-MS/MS检测茶叶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸和草铵膦残留

石雪芬，石美莲

（深圳信测标准技术服务有限公司，广东深圳 518000）

随着全球范围的百草枯禁限用不断加大，草铵膦继草甘膦之后，成长为第二大除草剂，近年来市场比重加大。草甘膦和草铵膦属于灭生性除草剂，有广谱、低毒、高效等综合性质，被广泛施用于果园，其残留问题越来越受到关注。目前关于草甘膦和草铵膦毒性问题存在争议，但由于两者农药使用范围广，用量大，不排除通过食物链对动物及人体产生潜在毒性。《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）规定了茶叶中草铵膦和草甘膦的限量[1]。

草甘膦及产物氨甲基膦酸和草铵膦常用的检测方法有分光光度法、电感耦合等离子光谱法（ICP）、色谱法（IC、LC、GC）、质谱法（LC-MS/MS、GC-MS），然而气质法需衍生气化后才能用，过程繁琐。液相色谱紫外法基质较复杂，定性难度大，而LC-MS/MS具有较高的选择性和灵敏度[2]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

茶叶，购自农贸市场；氯甲酸-9-芴基甲酯，纯度99.0%；乙腈、甲酸、乙酸铵，均为色谱纯试剂；标准物质（草甘膦 100 μg/mL，k=2，3%；氨甲基膦酸 100 μg/mL，k=2，3%；草铵膦100 μg/mL，k=2，3%。A Chemtek Inc.标准物质草甘膦-13C215N 99.9 μg/mL，k=2，3%），购自坛墨质检科技股份有限公司。

1.1.2 仪器

液相色谱-质谱联用仪，SCIEX TRIPLE QUAD™4500；万分之一电子天平，上海精其FA2204N；多管涡旋混旋仪，上海精其LF-200；台式离心机，凯特TD5；数显恒温水浴锅，DK-S24；水浴恒温振荡器，HA2A。

1.2 溶液的配制

①硼酸钠溶液（50.0 g/L，pH=9）。称取5 g硼酸钠，用水溶解并定容至100 mL。②氯甲酸-9-芴基甲酯乙腈溶液（FMOC-Cl）。称取1 g氯甲酸-9-芴基甲酯，用乙腈溶解并定容至100 mL。③乙酸铵溶液（0.1%甲酸溶液）。称取0.154 g乙酸铵溶于适量水中，用水定容1 000 mL后加入甲酸1 mL。

1.3 样品的提取、净化和衍生。

①精密称取茶叶（1±0.01）g，置于离心管中，加入1 μg/mL的内标0.20 mL和10 mL 0.05 mol/L NaOH溶液，涡旋混匀40 ℃水浴振荡提取20 min，离心后取2 mL上清液于装有50 mg PSA的10 mL离心管中净化，再取净化试液1.0 mL至离心管中，加入0.2 mL的硼酸钠溶液，摇匀后再加入0.2 mL FMOC-Cl衍生试剂，涡旋混匀振摇后置于40 ℃衍生4 h，离心后过水系滤膜，供液质分析，同时做空白试验。②分别配制浓度为1～80 ng/mL，且内标浓度为10 ng/mL的混标，各取1 mL，衍生与样品同法操作[3]。

1.4 仪器设备及参数信息

1.4.1 色谱条件

仪器型号：SCIEX TRIPLE QUAD™ 4500；色谱柱信息：Agilen（tUSDAY64791）；类型：ZORBAX SB-C18；规格：2.1 mm×50 mm，1.8 μm；流动相：A为乙腈，B为2 mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸溶液）；流速：0.35 mL/min；进样量：5 μL；柱温：40 ℃；梯度：0.3～3.0 min，90%的A保持1 min；2～3 min A相降低至10%；3.1 min A相升高至90%并保持2 min至5 min结束。

1.4.2 质谱条件

离子源：ESI+源；模式：正模式；扫描模式为MRM；离子源温度500 ℃，离子源气压50 psi；离子喷雾电压5 500 V；气帘气25 psi；碰撞气8 psi，衍生物参数见表1。

表1 衍生物参数

2 结果与分析

2.1 草甘膦含量的计算

草甘膦的含量是以草甘膦及其代谢物氨甲基磷酸之和计，若以草甘膦表示则需换算，查资料可知草甘膦的分子量为169.07，氨甲基磷酸的分子量为111.04，氨甲基磷酸换算为草甘膦的系数为0.656 8；即以草甘膦表示的结果计算公式为：草甘膦的含量+氨甲基磷酸的含量 ×0.656 8。

2.2 方法的线性、检出限及定量限

标准系列浓度为1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和80 ng/mL，验证正确度和精密度时，3水平浓度平行取样测定6次。结果见表2。

表2 方法的线性、检出限及定量限

2.3 流动相的优化

试验表明，流动相优化包括乙腈-水、乙腈-2mmol/L甲酸铵、乙腈-2mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）、乙腈-5mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）。结果表明，采用乙腈-2mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）作为流动相，缓冲体系更稳定，能提高目标化合物离子化效率，化合物分离度和灵敏度都达到最佳[4]。

2.4 提取剂的优化及净化材料的选取

草甘膦及代谢物氨甲基磷酸和草铵膦均是强极性化合物，难溶于丙酮、二氯甲烷等有机溶剂。试验选取乙腈（0.1%甲酸）、pH=6.0的水溶液、0.05 mol/L NaOH溶液等作为提取溶剂茶叶中的3种目标分析物进行提取。同时对比了不同的净化材料，如C18、CAX固相萃取柱、50 mg PSA、100 mg PSA、二氯甲烷试剂，综合考虑成本、提取效率等因素，最终采用0.05 mol/L NaOH溶液等作为提取溶剂，50 mg PSA作为净化材料提取目标分析物效果最好[5]。

2.5 衍生剂时间的优化

草甘膦及代谢物氨甲基磷酸和草铵膦分子量较小，直接检测信号不强。而在碱性环境（pH=9）下，通过FOMC-基团取代目标化合物氮原子上的氢，生成较稳定的化合物FOMC-R。在茶叶基质中添加过量衍生试剂条件下，对衍生反应时间（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和24 h）进行优化，结果表明在40 ℃，pH=9时衍生反应4 h后，测得衍生化合物含量无明显增加，确认了最佳的衍生时间，结果见图1。

图1 不同时间衍生结果的趋势图

3 结论

本方法研究同时检测茶叶中草甘膦及其代谢物氨甲基磷酸和草铵膦残留，优化了色谱条件的前处理条件，从农贸市场随机采购了茶叶，采用0.05 mol/L NaOH溶液等作为提取溶剂，50 mg PSA作为净化材料提取，加标浓度为0.01～0.60 mg/kg，精密度为1.03%～2.36%，回收率为81.8%～107.2%，得到较为满意的测试方法，过程高效，简单快速，可用于大批量样品的快速检测。