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中药复方联合三苯氧胺对MCF-7乳腺癌细胞HER-2基因及MAPK信号传导通路的影响*

2021-02-14周跃华殷东风

西部中医药 2021年12期
关键词:引物通路乳腺癌

周跃华,殷东风

辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳110032

乳腺癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤。统计显示[1],每8位妇女中就有1人会被诊断为乳腺癌,并且,其发病率呈逐年上升趋势,以每年3%~4%的速度递增,而且有年轻化趋势。HER-2是一种原癌基因,HER-2过表达型乳腺癌普遍存在低分化、病情进展迅速、高侵袭性等特点[2-3],成为判断性乳腺癌预后危险因子之一。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径,在细胞的恶性转化、肿瘤的发生发展、肿瘤的侵袭转移、肿瘤的多药耐药等方面起到至关重要的作用。MAPKs主要由ERKs、JNK/SAPK、p38MAPK、MK1/ERK5四个家族成员组成,其中ERKs(细胞外调节蛋白激酶1/2,ERK1/2)信号转导通路与乳腺癌的关系最为密切。乳腺癌为激素依赖型恶性肿瘤,研究表明将ER(+)的MCF-7乳腺癌细胞长期置于雌激素匮乏的环境中,雌激素受体α(estrogen receptor,ERα)表达将明显降低,ERα为MAPK信号通路的下游因子,MAPK通路活性增加可以促进ERα的转录及翻译。前期实验[4]发现中药复方乳岩宁具有下调HER-2蛋白表达的作用,本研究进一步观察中药复方联合三苯氧胺(tamoxifen,TAM)对乳腺癌HER-2mRNA及ERK1/2、ERα蛋白表达变化的影响,为乳腺癌多靶点联合治疗以及中西医结合治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物BALB/C裸鼠40只,雌性,4~6周龄,体质量(20±2)g,购自上海斯莱克实验动物有限公司。实验动物合格证号:SCXK(沪)2007-0005。饲养条件:动物饲养于辽宁中医药大学实验动物中心IVC笼具中,垫料、饲料均无菌处理。

1.2 实验材料人乳腺癌细胞株MCF-7(美国标准生物品收藏中心ATCC,ER阳性,中科院上海细胞生物学研究所);兔抗ERK1/2抗体(Cell signaling公司,批号:14);兔抗ERa抗体(北京博奥森生物,批号:909086W);鼠抗β-actin抗体;DNA Marker、RT-PCR试剂盒(大连TaKaRa公司,批号:RR066A);cDNA第一链合成试剂盒,Taq酶(北京康为世纪生物,批号:CW2849);HER-2基因引物序列设计及合成(北京奥科生物技术有限责任公司);DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂);MyCycler型梯度PCR扩增仪(美国BIO-RAD)。

1.3 试药制备乳岩宁方药物组成:柴胡10 g,太子参15 g,法半夏10 g,黄芩15 g,炙甘草10 g,生龙骨30 g,生牡蛎30 g,白花蛇舌草20 g,半枝莲20 g,莪术15 g,浙贝母15 g。益气消积方药物组成:太子参15 g,白术15 g,麦冬15 g,生黄芪20 g,炙甘草10 g,沙参15 g,茯苓15 g,莪术15 g,浙贝母15 g,白花蛇舌草20 g,半枝莲20 g。以上药物一次性购于辽宁中医药大学附属医院,按照常规水煎煮,浓缩至终浓度为3.3 g/mL,4℃冰箱保存备用。他莫西芬片(扬子江药业,国药准字H32021472,规格:10mg/片),蒸馏水溶解,调节生药浓度1.2 g/L备用。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备取对数生长期的浓度为1×107/mL的MCF-7细胞调节活细胞,无菌条件下接种于鼠右侧胸壁第二乳垫下,0.2 mL/只,裸鼠继续饲养于层流罩中。接种后10~15天,在接种部位处出现质硬结节,并 逐渐增大,认为成瘤,造模成 功[5]。

1.4.2 分组及给药将40只造模成功的裸鼠随机分为模型组、TAM组、乳结合组、益结合组,每组10只。根据人和鼠给药剂量换算公式[6]计算各组给药的剂量。模型组给予蒸馏水0.2 mL/只;TAM组给予TAM 3.6 μg/g(相当于成人临床用量的9倍);乳结合组给予乳岩宁33.3 g/kg(相当于成人临床用量的12倍)+TAM 3.6 μg/g;益结合组给予益气消积方35.3 g/kg(相当于成人临床用量的12倍)+TAM 3.6 μg/g。各组每日灌胃1次,连续给药21天。

1.5 观察指标

1.5.1 一般状态观察各组大鼠体质量、活动量、进食等表现。

1.5.2 ERK1/2、ERα蛋白表达-20℃冰箱中取出样本,取标本100 mg,加入冰预冷的细胞裂解液500 μL,组织匀浆,采用酚试剂法测定蛋白质含量,制备12%分离胶与4%浓缩胶,SDS-聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳,转印,杂交,碱性磷酸酶法显色,并以β-actin内参蛋白作为对照,扫描照相,用Scion Image软件对蛋白电泳带的进行灰度值检测,进行定量分析。

1.5.3 HER-2mRNA的表达Trizol提取肿瘤组织总RNA,采用紫外可见光分光光度计测定RNA浓度和纯度,逆转录合成cDNA,HER-2基因引物序列引物参照文献报道;β-actin引物设计参照Genebank的cDNA序列,按照PCR反 应 条件进 行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳,电泳结果采用Flour Chem V2.0凝胶成像分析软件(America)分析,记录每条HER-2和β-actin扩增带的灰度值,用β-actin做内参照,将HER-2DNA扩增片段的灰度值与相应的内参β-actin扩增片段灰度值的比值作为HER-2mRNA的半定量指标。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法采用SPSS 10.0软件进行统计学分析,计量资料以表示,采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态各组给药一周后除模型组外,各用药组荷瘤裸鼠体质量均下降,形体消瘦,活动量减少,进食减少,喜蜷卧,以TAM组表现最明显,在给药的第19天,TAM组1只裸鼠因肿瘤消耗最终死亡,死亡时体质量14 g,经解剖检查排除其他原因死亡。而两个结合组裸鼠由于肿瘤消耗,体质量也有不同程度下降,但状态保持相对较好,直到实验结束无死亡。

2.2 ERK1/2、ERα蛋白,HER-2 mRNA表达与模型组比较,TAM组、乳结合组及益结合组,ERK1/2、ERα蛋白、HER-2 mRNA表达均降低(P<0.01);乳结合组及益结合组较TAM组降低更明显(P<0.01);乳结合组与益结合组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1—3。

表1 各组大鼠ERK1/2、ERα蛋白,HER-2 mRNA表达比较(

表1 各组大鼠ERK1/2、ERα蛋白,HER-2 mRNA表达比较(

注:☆表示与模型组比较,P<0.01;★表示与TAM组比较,P<0.01;◆表示与乳结合组比较,P>0.05

HER-2 mRNA 0.62±0.023 0.51±0.041☆0.42±0.004☆★0.41±0.008☆★◆组别模型组TAM组乳结合组益结合组鼠数10 9 10 10 ERK1/2 219.14±5.91 179.64±5.46☆161.34±5.03☆★159.54±4.16☆★◆ERα 224.33±7.59 187.33±4.97☆172.33±6.24☆★173.37±4.81☆★◆

图1 各组大鼠瘤组织中ERK1/2、ERα蛋白表达

图2 各组大鼠瘤组织中HER-2 mRNA的表达

图3 各组大鼠瘤组织中β-actin mRNA的表达

3 讨论

HER-2基因又称人类表皮生长因子受体2(epidermal growth factor receptor,EGF2),乳腺癌HER-2基因参与调控细胞生长,其基因扩增或蛋白过度表达与肿瘤恶性生物学行为相关;在治疗方面,HER-2(+)较HER-2(-)的乳腺癌患者能从蒽环类新辅助化疗中获得更高的有效率[7]。

HER-2/MAPK信号转导通路在HER-2(+)乳腺癌患者中普遍处于活化状态,通路的高活性常提示癌细胞低分化、高增殖、易转移、预后差。其机制可能与乳腺癌细胞中HER-2/neu基因的过表达能够通过激活PI3K和ERK通路导致野生型P53蛋白含量减少有关[8]。本研究所采用的MCF-7细胞ER(+),为激素依赖型乳腺癌。研究表明,在雌激素匮乏的条件下,HER-2具有类雌激素样的促进细胞增殖作用,主要通过激活ERK/MAPK信号转导通路中c-fos、ERα等,促进癌细胞的恶性浸润性生长[9]。乳腺癌的治疗方式除了手术、放化疗外,还有内分泌治疗,而TAM是最具代表性的内分泌治疗药物,绝经前及绝经后患者均可以使用。本实验选用TAM作用于MCF-7乳腺癌动物模型后,研究发现各处理组均可下调HER-2 mRNA的表达,以两个结合组最为明显,HER-2 mRNA的表达水平下降,可以抑制MAPK信号通路的活性,故其下游激酶ERK1/2、ERα蛋白的表达水平也下降,说明中药复方联合TAM抑制乳腺癌生长可能是通过下调HER-2 mRNA的表达,抑制MAPK信号通路的活性,使ERK1/2、ERα蛋白表达减少来实现的,而且单纯抑制HER-2 mRNA表达本身就可以抗肿瘤。

上述实验结果表明雌激素受体拮抗剂TAM可通过抑制MAPK信号通路来抗肿瘤,与文献报道[10]相一致。马云飞等[11]研究发现焦虑、抑郁、睡眠障碍与肝肾亏虚证、肝郁脾虚证、脾肾亏虚证、心肾不交证均有一定的相关性。而肝肾亏虚型康复期乳腺癌患者更易合并疲乏、焦虑、抑郁、睡眠障碍。刘胜[12]教授认为正气亏虚、肝肾不足、冲任失调、痰毒瘀结为乳腺癌发病的根本病因;正虚毒留、余毒旁窜是晚期乳腺癌复发转移的关键因素;治疗应以宣肺、补心、疏肝、健脾、温肾等法进行辨证论治。

乳岩宁方是辽宁中医药大学附属医院肿瘤科的协定方。殷东风[13]教授认为,肿瘤的发生、发展与气机升降失常关系密切,气机升降出入异常是导致患者出现各种变证的重要原因。乳岩宁方由《伤寒论》中的柴胡加龙骨牡蛎汤加减化裁而来,针对乳岩肝郁气滞的病机,以小柴胡汤为主方和解少阳,调畅肝脏之气机,调整气机的升降紊乱以枢利全身气机,经临床及实验证明小柴胡汤具有抗肿瘤之功效,加入生龙骨、生牡蛎以镇定安神,软坚散结,辅以山慈菇、莪术、浙贝母等。诸药配伍共奏调畅气机、扶正抗癌、软坚散结之功效。根据肿瘤病机“全身为虚,局部为实”,治疗应以扶正祛邪兼顾为主,以四君子汤及沙参麦冬汤为基础方加减而成益气消积方,尤其适用于中晚期的恶性肿瘤患者。关于乳岩宁方及益气消积方我们进行了大量的临床及实验研究。研究表明,该药安全可靠,对恶性肿瘤具有治疗作用,在肿瘤各阶段均可应用,可改善患者生存质量[14-15]。

本研究发现,中药复方乳岩宁方及益气消积方联合TAM可下调原癌基因HER-2 mRNA的表达,通过MAPK信号通路下调ERK1/2的表达,从而减少ERa蛋白的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖。此外,还发现中药复方乳岩宁方及益气消积方可加强TAM的疗效。

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