中药复方联合三苯氧胺对MCF-7乳腺癌细胞HER-2基因及MAPK信号传导通路的影响*

周跃华，殷东风

辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳110032

乳腺癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤。统计显示［1］，每8位妇女中就有1人会被诊断为乳腺癌，并且，其发病率呈逐年上升趋势，以每年3%～4%的速度递增，而且有年轻化趋势。HER-2是一种原癌基因，HER-2过表达型乳腺癌普遍存在低分化、病情进展迅速、高侵袭性等特点［2-3］，成为判断性乳腺癌预后危险因子之一。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径，在细胞的恶性转化、肿瘤的发生发展、肿瘤的侵袭转移、肿瘤的多药耐药等方面起到至关重要的作用。MAPKs主要由ERKs、JNK/SAPK、p38MAPK、MK1/ERK5四个家族成员组成，其中ERKs（细胞外调节蛋白激酶1/2，ERK1/2）信号转导通路与乳腺癌的关系最为密切。乳腺癌为激素依赖型恶性肿瘤，研究表明将ER（+）的MCF-7乳腺癌细胞长期置于雌激素匮乏的环境中，雌激素受体α（estrogen receptor，ERα）表达将明显降低，ERα为MAPK信号通路的下游因子，MAPK通路活性增加可以促进ERα的转录及翻译。前期实验［4］发现中药复方乳岩宁具有下调HER-2蛋白表达的作用，本研究进一步观察中药复方联合三苯氧胺（tamoxifen，TAM）对乳腺癌HER-2mRNA及ERK1/2、ERα蛋白表达变化的影响，为乳腺癌多靶点联合治疗以及中西医结合治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物BALB/C裸鼠40只，雌性，4～6周龄，体质量（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。实验动物合格证号：SCXK（沪）2007-0005。饲养条件：动物饲养于辽宁中医药大学实验动物中心IVC笼具中，垫料、饲料均无菌处理。

1.2 实验材料人乳腺癌细胞株MCF-7（美国标准生物品收藏中心ATCC，ER阳性，中科院上海细胞生物学研究所）；兔抗ERK1/2抗体（Cell signaling公司，批号：14）；兔抗ERa抗体（北京博奥森生物，批号：909086W）；鼠抗β-actin抗体；DNA Marker、RT-PCR试剂盒（大连TaKaRa公司，批号：RR066A）；cDNA第一链合成试剂盒，Taq酶（北京康为世纪生物，批号：CW2849）；HER-2基因引物序列设计及合成（北京奥科生物技术有限责任公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；MyCycler型梯度PCR扩增仪（美国BIO-RAD）。

1.3 试药制备乳岩宁方药物组成：柴胡10 g，太子参15 g，法半夏10 g，黄芩15 g，炙甘草10 g，生龙骨30 g，生牡蛎30 g，白花蛇舌草20 g，半枝莲20 g，莪术15 g，浙贝母15 g。益气消积方药物组成：太子参15 g，白术15 g，麦冬15 g，生黄芪20 g，炙甘草10 g，沙参15 g，茯苓15 g，莪术15 g，浙贝母15 g，白花蛇舌草20 g，半枝莲20 g。以上药物一次性购于辽宁中医药大学附属医院，按照常规水煎煮，浓缩至终浓度为3.3 g/mL，4℃冰箱保存备用。他莫西芬片（扬子江药业，国药准字H32021472，规格：10mg/片），蒸馏水溶解，调节生药浓度1.2 g/L备用。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备取对数生长期的浓度为1×107/mL的MCF-7细胞调节活细胞，无菌条件下接种于鼠右侧胸壁第二乳垫下，0.2 mL/只，裸鼠继续饲养于层流罩中。接种后10～15天，在接种部位处出现质硬结节，并 逐渐增大，认为成瘤，造模成 功［5］。

1.4.2 分组及给药将40只造模成功的裸鼠随机分为模型组、TAM组、乳结合组、益结合组，每组10只。根据人和鼠给药剂量换算公式［6］计算各组给药的剂量。模型组给予蒸馏水0.2 mL/只；TAM组给予TAM 3.6 μg/g（相当于成人临床用量的9倍）；乳结合组给予乳岩宁33.3 g/kg（相当于成人临床用量的12倍）+TAM 3.6 μg/g；益结合组给予益气消积方35.3 g/kg（相当于成人临床用量的12倍）+TAM 3.6 μg/g。各组每日灌胃1次，连续给药21天。

1.5 观察指标

1.5.1 一般状态观察各组大鼠体质量、活动量、进食等表现。

1.5.2 ERK1/2、ERα蛋白表达-20℃冰箱中取出样本，取标本100 mg，加入冰预冷的细胞裂解液500 μL，组织匀浆，采用酚试剂法测定蛋白质含量，制备12%分离胶与4%浓缩胶，SDS-聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳，转印，杂交，碱性磷酸酶法显色，并以β-actin内参蛋白作为对照，扫描照相，用Scion Image软件对蛋白电泳带的进行灰度值检测，进行定量分析。

1.5.3 HER-2mRNA的表达Trizol提取肿瘤组织总RNA，采用紫外可见光分光光度计测定RNA浓度和纯度，逆转录合成cDNA，HER-2基因引物序列引物参照文献报道；β-actin引物设计参照Genebank的cDNA序列，按照PCR反 应 条件进 行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳，电泳结果采用Flour Chem V2.0凝胶成像分析软件（America）分析，记录每条HER-2和β-actin扩增带的灰度值，用β-actin做内参照，将HER-2DNA扩增片段的灰度值与相应的内参β-actin扩增片段灰度值的比值作为HER-2mRNA的半定量指标。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态各组给药一周后除模型组外，各用药组荷瘤裸鼠体质量均下降，形体消瘦，活动量减少，进食减少，喜蜷卧，以TAM组表现最明显，在给药的第19天，TAM组1只裸鼠因肿瘤消耗最终死亡，死亡时体质量14 g，经解剖检查排除其他原因死亡。而两个结合组裸鼠由于肿瘤消耗，体质量也有不同程度下降，但状态保持相对较好，直到实验结束无死亡。

2.2 ERK1/2、ERα蛋白,HER-2 mRNA表达与模型组比较，TAM组、乳结合组及益结合组，ERK1/2、ERα蛋白、HER-2 mRNA表达均降低（P＜0.01）；乳结合组及益结合组较TAM组降低更明显（P＜0.01）；乳结合组与益结合组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1—3。

表1 各组大鼠ERK1/2、ERα蛋白，HER-2 mRNA表达比较（

表1 各组大鼠ERK1/2、ERα蛋白，HER-2 mRNA表达比较（

注：☆表示与模型组比较，P＜0.01；★表示与TAM组比较，P＜0.01；◆表示与乳结合组比较，P＞0.05

HER-2 mRNA 0.62±0.023 0.51±0.041☆0.42±0.004☆★0.41±0.008☆★◆组别模型组TAM组乳结合组益结合组鼠数10 9 10 10 ERK1/2 219.14±5.91 179.64±5.46☆161.34±5.03☆★159.54±4.16☆★◆ERα 224.33±7.59 187.33±4.97☆172.33±6.24☆★173.37±4.81☆★◆

图1 各组大鼠瘤组织中ERK1/2、ERα蛋白表达

图2 各组大鼠瘤组织中HER-2 mRNA的表达

图3 各组大鼠瘤组织中β-actin mRNA的表达

3 讨论

HER-2基因又称人类表皮生长因子受体2（epidermal growth factor receptor，EGF2），乳腺癌HER-2基因参与调控细胞生长，其基因扩增或蛋白过度表达与肿瘤恶性生物学行为相关；在治疗方面，HER-2（+）较HER-2（-）的乳腺癌患者能从蒽环类新辅助化疗中获得更高的有效率［7］。

HER-2/MAPK信号转导通路在HER-2（+）乳腺癌患者中普遍处于活化状态，通路的高活性常提示癌细胞低分化、高增殖、易转移、预后差。其机制可能与乳腺癌细胞中HER-2/neu基因的过表达能够通过激活PI3K和ERK通路导致野生型P53蛋白含量减少有关［8］。本研究所采用的MCF-7细胞ER（+），为激素依赖型乳腺癌。研究表明，在雌激素匮乏的条件下，HER-2具有类雌激素样的促进细胞增殖作用，主要通过激活ERK/MAPK信号转导通路中c-fos、ERα等，促进癌细胞的恶性浸润性生长［9］。乳腺癌的治疗方式除了手术、放化疗外，还有内分泌治疗，而TAM是最具代表性的内分泌治疗药物，绝经前及绝经后患者均可以使用。本实验选用TAM作用于MCF-7乳腺癌动物模型后，研究发现各处理组均可下调HER-2 mRNA的表达，以两个结合组最为明显，HER-2 mRNA的表达水平下降，可以抑制MAPK信号通路的活性，故其下游激酶ERK1/2、ERα蛋白的表达水平也下降，说明中药复方联合TAM抑制乳腺癌生长可能是通过下调HER-2 mRNA的表达，抑制MAPK信号通路的活性，使ERK1/2、ERα蛋白表达减少来实现的，而且单纯抑制HER-2 mRNA表达本身就可以抗肿瘤。

上述实验结果表明雌激素受体拮抗剂TAM可通过抑制MAPK信号通路来抗肿瘤，与文献报道［10］相一致。马云飞等［11］研究发现焦虑、抑郁、睡眠障碍与肝肾亏虚证、肝郁脾虚证、脾肾亏虚证、心肾不交证均有一定的相关性。而肝肾亏虚型康复期乳腺癌患者更易合并疲乏、焦虑、抑郁、睡眠障碍。刘胜［12］教授认为正气亏虚、肝肾不足、冲任失调、痰毒瘀结为乳腺癌发病的根本病因；正虚毒留、余毒旁窜是晚期乳腺癌复发转移的关键因素；治疗应以宣肺、补心、疏肝、健脾、温肾等法进行辨证论治。

乳岩宁方是辽宁中医药大学附属医院肿瘤科的协定方。殷东风［13］教授认为，肿瘤的发生、发展与气机升降失常关系密切，气机升降出入异常是导致患者出现各种变证的重要原因。乳岩宁方由《伤寒论》中的柴胡加龙骨牡蛎汤加减化裁而来，针对乳岩肝郁气滞的病机，以小柴胡汤为主方和解少阳，调畅肝脏之气机，调整气机的升降紊乱以枢利全身气机，经临床及实验证明小柴胡汤具有抗肿瘤之功效，加入生龙骨、生牡蛎以镇定安神，软坚散结，辅以山慈菇、莪术、浙贝母等。诸药配伍共奏调畅气机、扶正抗癌、软坚散结之功效。根据肿瘤病机“全身为虚，局部为实”，治疗应以扶正祛邪兼顾为主，以四君子汤及沙参麦冬汤为基础方加减而成益气消积方，尤其适用于中晚期的恶性肿瘤患者。关于乳岩宁方及益气消积方我们进行了大量的临床及实验研究。研究表明，该药安全可靠，对恶性肿瘤具有治疗作用，在肿瘤各阶段均可应用，可改善患者生存质量［14-15］。

本研究发现，中药复方乳岩宁方及益气消积方联合TAM可下调原癌基因HER-2 mRNA的表达，通过MAPK信号通路下调ERK1/2的表达，从而减少ERa蛋白的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖。此外，还发现中药复方乳岩宁方及益气消积方可加强TAM的疗效。