生物炭对连作棉田细菌群落及代谢通路的影响

韩光明，蓝家样，陈全求，张胜昔，李国荣

（湖北省农业科学院经济作物研究所/农业农村部长江中游棉花生物学与遗传育种重点实验室，武汉430064）

生物炭作为一种环境友好型土壤改良剂已被广泛应用于农业障碍性土壤的改良，对农业土壤的质量产生了积极的影响[1]。中国人口众多，对基本农产品的需求也较高，相对来说可耕地面积并不充足，因而连作现象比较普遍。然而，棉田连作不仅引起土壤严重退化，进而引起棉花产量下降。大多数农民都采用土壤改良技术来帮助恢复土壤完整性[1]。尽管大多数研究关注使用生物炭对农业生产力的好处，长期连续施用生物炭被证实对棉田土壤细菌群落的多样性有显著影响[2]，但生物炭处理对不同连作年限棉田土壤细菌群落及代谢途径的研究相对较少[3-4]。事实上，很少有关于施用生物炭对长期连作（超过20a）棉田土壤细菌群落组成的影响的研究。此外，这些研究也未能整合使用生物信息学技术提高研究结果和推论的准确性[2]。因此，为了确定生物炭作为土壤改良剂应用于多种长期连作土壤而引起的土壤细菌群落的响应，有必要整合生物信息学综合分析技术以提高分析的可靠性[5]。通过探究在不同连作年限棉田中施用不同量的生物炭作为土壤改良剂对土壤细菌群落结构的影响，利用16SrRNA基因的高通量测序和基于生物信息学技术测定土壤细菌群落组成、关键物种、土壤细菌结构和代谢功能，以及土壤微生物成分、比例和多样性，以期为确定生物炭在不同连作年限棉田的最佳施用量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验地点位于新疆博乐市新疆金博种业中心的中试基地（北纬44°46′56.0”，东经82°23′57.0”）。该地区位于新疆西北部的温带地区，与哈萨克斯坦接壤。年平均气温-17～23°C，平均降水量为181mm。选用湖北省农科院经济作物研究所自育棉花（Gossypiumspp）品种ZD2040，该品种早熟抗黄萎病性强，青枝绿叶吐白絮。供试土壤样品是从常规连续耕种5，10，20，40a棉田的表层（0～15cm）获取的。根据联合国粮食和农业组织（FAO）分类指南，获得的采样土壤分类为强淋溶土，粘土含量为66.3%。供试土壤理化性质见表1。

供试生物炭为山东丰本生物科技有限公司生产，是玉米芯经炭化炉高温热解获得，加热速率为10℃·min-1，加热到550℃。供试生物炭的理化性质见表1。

表1 供试生物炭及土壤的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of biochar and soil in the study

1.2 方法

为研究不同生物炭施用量（0，20，40t·hm-2）对不同连作年限（5，10，20，40a）棉田土壤细菌群落的影响，试验共设12个处理，每个处理重复3次，共36个试验区。在各试验区清除石头和植物残渣后，将表层土与生物炭均匀混合。于2017年4月15日播种，行距50cm，株距10cm。试验采用完全随机区组设计。在整个试验过程中采用人工除草，并在必要时浇水。生育期各试验区统一施用同种复合肥料（N∶P∶K=15∶15∶15）。

花铃期（7月25日）在棉花植株周围5cm的范围内0～15cm深的土壤中随机取10个土壤样本，每个样本取土100g；将重复样本混匀后装入冰盒，6h内运送到实验室，1周内分析理化参数。将一部分土壤样品冷冻保存（-80°C），用于土壤微生物分析，另一部分进行风干，研磨、过筛（1～2mm）后进行理化分析。

1.2.1 DNA提取及16SrRNA的PCR扩增 参照HAN等[2]的方法，使用土壤微生物总DNA提取试剂盒（OmegaBio-Tec，Inc.，USA）从土壤样品中直接提取基因组DNA。在1%琼脂糖凝胶上运行10μL的DNA样品评估提取DNA的质量。利用融合引物（正向引物341F：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG；反向引物805R：GACTGGAG TTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）通过PCR对微生物基因组DNA 16SrRNA V3～V4的高可变性区域进行扩增。反应总体积50μL，包含5μL 10×PCR反应缓冲液（日本TakaRa），10ng DNA模板，前后引物各0.5μL，0.5μL dNTPs和0.5μL白金聚合酶（TakaRa，日本）。PCR扩增程序为：初始94℃3min，94℃30s，45℃退火20s，65℃退火30s，重复5个循环，随后94℃持续20s，55℃持续20s和72℃持续30s，然后重复20个循环，最后72℃延伸5min。在1.5%琼脂糖凝胶上进行PCR扩增产物的特异性测试，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。

1.2.2 Illumina测序及数据处理 参考HAN等[2]的方法，略有改动。使用Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）系统的双端测序法对V3和V4扩增子进行测序。对测序数据进行质量控制检查，并使用Prinseq软件（PRINSEQ-lite 0.19.5）删除质量较差的测序数据。使用Flash软件（FLASH v1.2.7），在无错配的10bp读段重叠的基础上，组装V3和V4双端测序读段，丢弃未组装的读段。从组装的重叠群中适当修剪编码区和测序引物。使用Uclust软件（Uclust v1.1.579）对序列进行聚类，并使用3%的相似度将其分配给操作分类单位（OTU）。使用Greengenes数据库上核糖体数据库（RDP）朴素贝叶斯分类器（v.2.2），为每个序列分配分类学等级[6]。

1.2.3 分类地位鉴定 使用QIIME软件实现操作分类单元（OTU）的识别，该软件将OTU代表序列与相应数据库的模板序列进行比较，以获得与每个OTU对应的分类信息。每个特定的数据库都用作不同类别序列的OTU分类状态标识的模板序列[7]。利用MEGAN软件（http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan6/）[8]构建系统进化树和分类树，将每个样本中包含的OTU丰度信息和分类学组成数据映射到NCBI网站（https://www.NCBI.nlm.nih.gov/Taxonomy）提供的微生物分类学层次树中，以在标准分类层次结构中显示每个分类级别上所有样本的具体组成。通过GraPhlAn（Asnicar et al.2015）和Krona软件[9]进行比较分析。

1.2.4 群落多样性分析 使用QIIME软件通过Chao 1，Ace，Shannon和Simpson指数计算群落多样性。根据OTU分类鉴定的结果计算每个样品在属水平下的组成。

1.2.5 主要物种的筛选 通过PLS-DA（偏最小二乘判别分析）进行细菌的比较分析和关键物种的筛选。

1.2.6 微生物代谢功能的簇分布和预测 通过R软件Venn图分析计算唯一和共享功能组的数量。利用KEGG数据库预测重要的微生物代谢功能（http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）。

1.2.7 数据统计分析 使用SPSS、QIIME和R软件对数据进行分析，计算均值差异，p值为0.05，使用LSD确定平均值之间的显著差异。使用Mothur中的t检验和Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）来比较差异，并使用R中mt.rawp2adjp功能的BH方法以错误发现率（FDR）调整所有p值。

2 结果与分析

2.1 生物炭对连作棉田细菌类别的影响

MiSeq Illuminas测序后，产生了超过400，000条有效序列，平均长度为400bp。具有97%以上同一性序列分布在24，417个OTU中。通过MEGAN和Krona分析软件对OTU进行比较分析，结果表明在属水平3种生物炭施用量下，代尔夫特菌属和苍白杆菌属被确定为连作棉田土壤中存在的优势细菌群（图1），与棉花连作的年限无关。0t·hm-2生物炭处理的优势菌属有乳酸杆菌属、代尔福特菌属、苍白杆菌属、寡养单胞菌属、无色杆菌属、鞘氨醇单孢菌属、根瘤菌属和甲基杆菌属。20t·hm-2生物炭处理的优势菌属有苍白杆菌属、代尔福特菌属、寡养单胞菌属、根瘤菌属、无色杆菌属、鞘氨醇单孢菌属、乳酸杆菌属、甲基杆菌属等。而40t·hm-2生物炭处理的优势菌属有苍白杆菌属、代尔福特菌属、寡养单胞菌属、无色杆菌属、根瘤菌、鲑色沉积物杆状菌属、甲基杆菌属和无枝酸菌属。使用GraPhlAn分析进一步证实了在20个相对丰富的细菌类群中，生物炭0t·hm-2施用量下单胞菌属的丰度最高，而生物炭在20t·hm-2和40t·hm-2的施用量下苍白杆菌属丰度最高。而且，在生物炭处理区，变形杆菌纲、布鲁氏菌科和丛毛单胞菌科的相对丰度显著增加，而黄单胞菌和丙型变形菌的相对丰度降低（图1）。

图1 生物炭对长期连作棉田土壤细菌分类学组成的影响Figure 1 Effect of biochar on bacterial taxonomy in long-term continuous cropping cotton fields

2.2 生物炭对连作棉田土壤细菌α多样性的影响

使用多种指标（Simpson、Chao 1、ACE和Shannon）表征供试土壤样品中微生物群落的α多样性。总的来说，Chao1和Ace指数衡量了微生物群落的丰富度，而Shannon和Simpson指数对微生物的丰富度以及稀有OUT、微生物均匀度和优势OUT则更敏感。使用QIIME软件计算了4种多样性指数。结果表明，施加生物炭提高了连作棉田微生物群落多样性，并且在生物炭施用量为20t·hm-2时最高，在连作20a棉田达显著水平（p＜0.05）（表3）。

表3 生物炭对连作棉田多样性指数的影响Table 3 The influence of index of diversity of biochar to continuous cropping cotton fields

2.3 生物炭对连作棉田土壤细菌β多样性的影响

β多样性反映不同连作年限间土壤微生物群落构成。根据给定的样本分布信息，对群落结构数据进行偏最小二乘判别分析（PLSDA）。样品的空间距离越接近，表示样品的物种组成结构越相似。对不同生物炭施用量处理下不同连作年限土壤样品进行PLSDA分析显示，不施用生物炭处理，连作20a以下3个棉田较接近，而连作40a棉田被明显分开，说明连作20a以下3个棉田细菌物种组成结构接近，与连作40a棉田细菌物种组成有较大差异。生物炭施用量为20t·hm-2时，不同连作年限棉田细菌物种组成差异不大。生物炭施用量为40t·hm-2时，连作40a棉田与连作20a及以下棉田的物种组成差异较大，说明20t·hm-2生物炭施用量可以有效改善长期连作棉田土壤微物的多样性，而40t·hm-2的生物炭施用量对连作40a以上棉田细菌群落影响较小（图2）。

图2 不同生物炭施用量下不同连作年限土壤样本间的偏最小二乘法判别分析Figure 2 Partial least squares discriminant analysis among samples with different continuous cropping years under different biochar application concentrations

2.4 微生物代谢功能的簇分布和预测

通过R软件计算，Venn图和PICRUSt功能预测分析独特共享功能组的结果表明（图3），在代谢功能上，最高细菌相对丰度（＞0.09）为碳水化合物和氨基酸代谢，而最低细菌相对丰度（＜0.01）为其他次生代谢产物的生物合成。基于细胞过程，最高的细菌相对丰度（＞0.02）都表现出细胞运动性，最低的细菌相对丰度（＜0.005）表现出细胞讯息传递。在环境信息处理方面，最高的细菌相对丰度（＞0.10）都表现为膜转运，而最低的细菌相对丰度（＜0.01）表现为信号分子和相互作用。在遗传信息处理方面，最高细菌相对丰度（＞0.05）表现为复制和修复，而最低细菌相对丰度（＜0.02）表现为折叠、分选和去辐射。

图3 不同生物炭施用量下不同连作年限独特和共享功能组分析Figure 3 Unique and shared functional group analysis for different continuous cropping years under different biochar application concentrations

3 讨论与结论

细菌多样性及其在土壤中相对比例的变化取决于不同的棉田生物炭处理和棉花连作年限。在20t·hm-2和40t·hm-2的生物炭施用量下，显著增加了连作20a棉田土壤的细菌多样性，而施用生物炭显著降低了连作40a棉田土壤细菌的多样性和丰富度。这些结果与LI等[10]的发现一致。生物炭处理对土壤微生物的影响是复杂且变化的，并且与生物炭的应用时间、类型和数量密切相关[10-12]。编码16SrRNA基因的测序已被广泛用于土壤中细菌群落的深入分析[13-14]。其与Chao 1、Ace、Shannon和Simpson的丰富度和多样性指数一起，用于评估生物炭处理棉田土壤中细菌群落的多样性。细菌类群在所有试验区差异显著（表3）。施用0，20，40t·hm-2生物炭的土壤与放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门等4种原生菌相关联。这与前人研究一致[8，15-16]。另外，正如CARSON等[17]揭示的那样，棉田持续连作改变了土壤环境的物理化学状态（例如pH，矿物质含量，孔隙和粒径）及水分和养分利用率，这也可能是影响细菌群落和土壤微生境的关键因素。

本研究表明，在生物炭施用量为0t·hm-2的情况下，连作5a和20a的棉田土壤样品间的OUT相似度更高；在生物炭施用量为20t hm-2，连作10a和20a的棉田土壤样品间OTU相似度更高；生物炭施用量在40t·hm-2下，连作5a和40a棉田土壤样品间OTU相似度更高。此外，UPGMA还证实了在生物炭3种施用量下，连续种植5a和20a的样品之间的OTU相似性均最高。这与CANNAVAN等（2016）[18]研究发现相一致，其研究发现生物炭影响包括微生物构成在内的几种土壤参数，并且生物炭可以潜在地容纳重要的微生物。当然，已经证明生物炭作为土壤改良剂对土壤细菌群落具有重大影响，这可能会改善棉田连作系统的微生物多样性[4，17]。

通过PLSDA进行的群落结构判别分析表明，组间差异主要表现在0t·hm-2生物炭施用量棉花连作5a和40a的样品、20t·hm-2生物炭施用量棉花连作20a和40a的样品、40t·hm-2生物炭施用量棉花连作20a和40a的样品。这证明了生物炭施用量和棉花连作对细菌群落结构的综合影响。AMARAL等[19]的一项研究表明，在农业生产中施用生物炭不仅影响土壤碳、氮和磷的含量，而且还影响细菌群落的组成和结构。根据微生物功能组的预测丰度，在20t·hm-2生物炭施用量下，共有的功能组数量最少，表明在该施用量下存在独特的土壤特性。独特功能组最高数量出现在0t·hm-2和20t·hm-2生物炭施用量下连作10a棉田，以及在40t·hm-2生物炭施用量下棉花连作40a棉田。研究表明细菌簇的分布与土壤性质如碳含量有关[19]，资源的有限利用可能会通过增强微生物运动来促进早期微生物簇的形成[20]。此外，在资源有限的环境中，为了生存以及早期微生物簇的形成，及其随后的动力学，微生物更喜欢相对簇生长模式而不是分散模式[20]。

理想情况下，细菌群落的整体代谢途径可以根据各自实体在代谢途径中起主要作用的必需资源的可用性，以及被用来调节微生物群落结构和功能重要的种间相互作用来预测[21]。本研究表明，即使棉花连作会影响细菌多样性，但基于其在整个生物炭处理中的代谢功能，这些细菌群落的丰度也没有明显变化。但是，代谢功能（碳酸盐和氨基酸代谢，细胞运动，膜运输，复制和修复等）表现为较高的细菌相对丰度。在生物炭处理下，连作20a棉田土壤表现出最佳的细菌丰度。碳水化合物和氨基酸代谢物相关细菌群落可能对整体土壤肥力有利。实际上，这提供了额外的证据，即生物炭的施用量和棉花连作不仅影响土壤细菌的多样性，而且还影响特定代谢功能的特定群落的相对丰度，其中一些有益于提高作物生产力。

研究结果表明，在连作20a棉田，施用生物炭对土壤细菌群落结构、α多样性、β多样性和代谢功能性质具有显著增益的效果，并且在生物炭施用量为20t·hm-2和40t·hm-2时表现为最高的细菌多样性。但是，与棉花连作20a相反，连作40a的较高生物炭施用量并未显著改变细菌的多样性。总体而言，施用20t·hm-2生物炭可促进40a以下连作棉田的细菌群落和代谢途径向有益于提高棉花生产力的方向发展。