钙果4号生根增殖一次性成苗培养基配方研究

魏 鹏， 任彦青， 詹 虹， 张存智， 王 肖

(1.宁夏职业技术学院生命科技学院， 银川 750021；2.宁夏农垦贺兰山种业有限公司马铃薯脱毒中心， 银川 750021)

培养基中植物生长调节剂的比例决定外植体器官分化的方向[1]，如生根还是脱分化形成愈伤，培养基中营养元素的配比影响器官分化的生长质量[2-4]，如根的粗细、叶片大小等。但基本培养基中营养元素种类较多，且往往存在交互作用，优化调整难度较大。许多组培配方的优化仅停留在激素水平，这也是许多经济木本植物组培繁殖成本太高、难以工厂化生产的主要原因。

钙果原名欧李(CerasushumilisBunge.)是蔷薇科樱桃属的一种矮小灌木，是我国特有果树，由于钙果果实含钙量极高，是儿童与老人的高级保健水果[5]，目前在宁夏境内已经推广种植[6]，未来很可能成为继枸杞、葡萄、树莓之后的又一区域主推经济果树[7]。通过组织培养技术繁殖钙果种苗相比扦插种苗基数使用较少，苗木发展初期有明显优势[8]。关于钙果的组培繁殖配方缺乏深度优化，大多绕开配方中影响器官分化质量的营养元素配比技术壁垒，因此苗子质量不高[9]，多数苗子根较细[10]，有效增殖系数偏低。

本研究以钙果4号(Cerasushumiliscv. Four)组培苗为例，研究其在生根基础上的分枝增殖技术，先通过对比试验确定出钙果4号组培苗基础生根配方中的生长素种类与浓度，然后借助均匀设计可大大减少试验次数的优势[11]，挑选科学匹配的均匀设计表，在该配方基础上，对培养基中的5种营养元素N、P、K、Ca、Mg对应化合物含量进行深度优化，通过苗子生根质量、腋芽萌发嫩梢质量筛选一次成苗配方，为下一步工厂化生产与移栽奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

钙果4号外植体取自银川市西夏区宁夏农垦设施园区大棚内(38°43′N，106°04′E)，苗子陆地生长超过2年。试管苗继代5次以上，生长稳定。

1.2 方 法

1.2.1基础生根配方中生长素种类与浓度优化实验

整个实验分3步进行，第一，以孙新政等[10]的钙果4号生根配方为对照(表1-ck)，采用MS配方，设置不同的生长素处理水平，剪取生长在同一配方中的钙果4号试管苗茎尖苗、茎段苗分别接入表1中12个配方，35 d后统计、比较试管苗根的生长状况与茎叶生长质量。

表1 不同生长素生根配方处理

1.2.2大量元素优化实验

以实验1的研究结果为基础，利用均匀设计对培养基中大量元素对应的化合物KNO3、NH4NO3、MgSO4·7 H2O、Ca(NO3)2·4 H2O浓度进行深度优化。MS培养基中KH2PO4的溶液显弱酸性，含量超过300 mg·L-1时培养基不凝固，处理配方中KH2PO4固定为1/2 MS浓度，为85 mg·L-1。均匀设计表选用官网http://www.math.hkbu.edu.hk/UniformDesign/4因素11水平试验U 11(114)，具体设置如表2所示。35 d后，统计苗子生根状况，以生根率为因变量，各化合物浓度为自变量，建立多元二次回归方程，利用Matlab软件对该方程求最优解。

表2 利用均匀设计对4种化合物进行不同水平设置 单位：mg·L-1

1.2.3重复验证实验

经激素一次优化与营养化合物二次优化试验，得到钙果4号组培苗一次成苗配方。分别将茎尖苗、茎段苗接入该配方培养基，观察、统计苗子生长状况，对该配方效果进行重复验证。

1.3 培养条件

茎尖与茎段分开接种，长度约1.3 cm，每种处理接种8瓶，每瓶5株苗。随机摆放在培养架上，培养室温度(26±2)℃，光照时间16 h·d-1，光照强度40 mol·(m2·s)-1。所有实验培养基加入蔗糖20 g·L-1, 琼脂粉4.2 g·L-1.

1.4 数据处理与图表制作

数据统计与方程拟合使用SPSS 26.0软件，图表制作使用Origin 2019软件和Excel 2019软件。

2 结果与分析

2.1 生长素种类与浓度的优化

由表3可知，不同配方，钙果4号茎尖试管苗生长差别较大，7、8、9、10、11等5个配方试管苗大部分枯死，尤其是8、9、10三个配方，试管苗生根率≤10%，离陆地移栽标准相差甚远。ck配方生根率为53%，茎尖枯死严重，茎叶生长不明显，愈伤组织较大较硬，未达到理想效果。综合生根率、生根数、茎叶鲜重及枯死状况，3号配方IAA 1.0 mg·L-1+MS适合钙果4号茎尖苗的生根培养，其中生根率与生根数2项指标表现突出。

表3 钙果4号茎尖苗接入不同配方生长状况对比

通过表4发现，钙果4号茎段苗在继代培养时多数腋芽都能萌发成梢。相比表3，钙果4号茎切段试管苗生根率整体低于茎尖苗，配方1、7、8、9、 10、11生根率极低，均≤11%，茎段苗生根状况与茎尖苗表现整体一致性。生根率配方最高的是4号，达到70%，1、8、9三个配方均未生根，腋芽的萌发情况较差。相比其他配方， 3号在茎段试管苗中表现优异，生根率为65%，生根条数较多，且较长，另外腋芽萌发良好，成梢均一，叶片展平成绿，为后续继代增殖提供了材料。综合表4，生根质量好的试管苗其主株高、腋芽萌发个数及腋梢长度均表现出一定优势，试管苗生长与茎叶生长表现密切相关。

2.2 营养元素的优化

将钙果4号茎切段试管苗接入均匀设计的11个配方，如表5所示，配方之间苗子生长状况差别较大，生根率在70%～76%之间的共有5个配方，其中h配方最高，为75%，结合每株根长、根数及腋芽萌发个数3项指标，苗子生根质量最优的是配方e。生根率在60%～67%之间共有2个配方，剩余配方生根率均低于54%，其中b配方最低，为24%。3号配方与表4表现基本一致，与均匀设计其他配方相比，苗子生长表现居中。

表4 钙果4号茎段苗接入不同配方生长状况对比

表5 钙果4号茎段苗接入均匀设计配方生长状况

通过11个配方的回归分析，以钙果4号茎切段试管苗生根率为依变量，各营养元素对应化合物浓度为自变量，建立回归方程：Y(生根率)=2.224[Ca(NO3)2·4 H2O]2+1.881[NH4NO3][Ca(NO3)2·4 H2O]-2.286[NH4NO3] [KNO3]-1.1[Ca(NO3)2·4 H2O] [MgSO4·7 H2O]+1.077[KNO3]+0.861[MgSO4·7 H2O]-2.98[Ca(NO3)2·4 H2O]+0.693，如图5所示，R2=0.982，F=23.235，p值小于0.05，多元二次回归方程拟合非常好。

利用软件Matlab 22.0对上述回归方程求最优解，当生根率Y等于最大值100%时，4种化合物的最优解是：[Ca(NO3)2·4 H2O]340.4 mg·L-1+[NH4NO3]500.2 mg·L-1+[KNO3]9.3 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]567.9 mg·L-1。

图1 11个配方苗子生根率实测值与方程计算值对比

2.3 重复验证

将钙果4号试管苗茎尖苗与茎段苗分别接入最终优化的生根配方3-1：蔗糖20 g·L-1+琼脂粉4.2 g·L-1+[Ca(NO3)2·4 H2O]340.4 mg·L-1+[NH4NO3]500.2 mg·L-1+[KNO3]9.3 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]567.9 mg·L-1+[KH2PO4]85 mg·L-1。

如图2所示，结合表3，配方3号与3-1茎尖苗腋芽均未萌发，这可能与该植物特性有关。茎尖苗生根率、生根数、根长2个配方差别不大，茎叶生长表现良好，无茎叶枯死现象。关键是茎切段苗，结合表4、表5，与配方3、h、e相比，生根率提高至87%，生根数、根长等明显提升。茎切段苗腋芽萌发个数达3.9个，细梢长度为2.68 cm，嫩梢着生叶片展平成绿，长势良好，具备下次继代有效增殖材料的剪切标准。

图2 钙果4号茎尖、茎段苗在配方3-1中的生长表现对比

3 讨 论

试管苗的生根质量直接影响后续移栽成活率，试管苗增殖系数偏低大大影响企业生产成本，因此生根技术与增殖技术是种苗能否工厂化生产的瓶颈[12]。本研究依据苗子生根质量与茎叶生长相关性的原理，巧妙利用钙果4号茎段试管苗生根状态下腋芽萌发成梢的特征，先通过生长素对比试验，筛选出钙果4号基础生根配方3号：蔗糖20 g·L-1+琼脂粉4.2 g·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+MS，将茎尖苗接入该配方，生根率为83%，每株根长为3.18 cm，每株生根数为7条，茎叶生长良好。茎段苗生根率仅为65%，生根质量一般，但发现有部分腋芽萌发成梢。

实际生产中，茎段苗数量远远多于茎尖苗，仅用茎尖苗移栽不符合生产需要。第二步，通过均匀设计利用回归分析结合Matlab软件对3号配方的中营养元素对应4种化合物浓度进行优化，得到茎段苗生根率提升至87%，腋芽萌发个数达到3.9个，细梢长度为2.68 cm的优良配方3-1：蔗糖20 g·L-1+琼脂粉4.2 g·L-1+[Ca(NO3)2·4 H2O]340.4 mg·L-1+[NH4NO3]500.2 mg·L-1+[KNO3]9.3 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]567.9 mg·L-1+[KH2PO4]85 mg·L-1，经反复验证，苗子生长良好。该举措通过生根配方技术和增殖技术的突破，达到一次成苗双赢效果。

利用愈伤组织诱导丛生芽是组培快速繁殖种苗的常用方式[12]，但芽体附着的叶片多簇拥、幼嫩[13]，茎杆也细嫩[14]，成梢长度有限[15]。通过腋芽萌发成梢相比丛生芽方式，增殖系数略低，但叶片展平良好，成熟度高，茎杆相对较粗较硬，潜在的有效繁殖能力明显较强，这也是钙果4号丛生芽质量不高[9-10]，本实验利用钙果4号茎段苗继代培养时腋芽萌发成梢的特征，通过腋芽增殖的主要原因。采用二次优化的配方3-1，保证了移栽的生根率，腋芽萌发成梢明显，腋芽萌发接近4个，平均长度为2.68 cm，在生根的基础上，达到增殖的效果，缩减了组培中间环节，为试管苗继代增殖及移栽后的陆地扦插提供了潜在材料。

培养基中的营养元素影响器官分化的质量，从技术角度讲，相比配方中激素的优化，营养元素及对应化合物浓度的优化难度太大，以MS为例，大量元素加微量元素共计12种，如果再设置不同的水平，实验次数就大大增加，因此组培配方的优化大多停留在激素水平。均匀设计在多因子多水平条件下可以大大减少试验次数[11]，优势明显，这与组培配方中营养元素种类较多，优化繁杂具有较高的应用契合度[16]。本实验核心研究就是利用均匀设计结合Matlab软件对配方3中的大量元素进行优化，得到优良配方3-1，提高了钙果4号茎切段试管苗的繁殖效率，验证了均匀设计在组织培养配方优化领域的科学适用性。

利用均匀设计优化组培配方营养元素配比问题也不少。首先，在网址http://www.math.hkbu.edu.hk/UniformDesign/上选择均匀设计表时，同因素同水平不要选用实验次数最少的设计表格，虽然最小设计表可以减少一定工作量，但在后续回归方程拟合时容易产生信息流失，影响方程拟合效果。本实验采用U11(114)表，虽然拟合出优良方程，建议用D(偏差值)更小、均匀度更好的U14(144)、U16(164)甚至U22(224)均匀表，这样更具科学性。第二，与一元一次方程相比，多元二次回归方程求解可能存在多个结果，必须通过试验逐个检验。如本试验得到回归方程Y=2.224[Ca(NO3)2·4 H2O]2+1.881[NH4NO3][Ca(NO3)2·4 H2O]-2.286[NH4NO3] [KNO3]-1.1[Ca(NO3)2·4 H2O] [MgSO4]+1.077[KNO3]+0.861[MgSO4·7 H2O]-2.98[Ca(NO3)2·4 H2O]+0.693，进行最优解时，还可以得到[Ca(NO3)2·4 H2O]282.4 mg·L-1+[NH4NO3]433.5 mg·L-1+[KNO3]155.7 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]534.7 mg·L-1，这与3-1配方差别较大，必须将钙果4号茎段试管苗接入进行检验，得到最终结果：[Ca(NO3)2·4 H2O]340.4 mg·L-1+[NH4NO3]500.2 mg·L-1+[KNO3]9.3 mg·L-1+[MgSO4·7 H2O]567.9 mg·L-1+[KH2PO4]85 mg·L-1。