秸秆覆盖还田对桑园土壤真菌群落结构组成的影响

2021-02-12吴银秀杨尚东屈达才

西南农业学报 2021年12期

肖健，吴银秀，杨尚东，屈达才

(广西大学农学院/广西大学蚕学研究所，广西南宁 530004)

【研究意义】桑树(MorusalbaL.)是我国重要的经济作物之一，其种质资源量稳居世界第一[1]。广西作为我国最大的桑蚕生产基地，无论是桑园面积还是蚕茧产量均连续多年位居全国首位，其中，2018和2019年桑园面积分别为22.85万和19.72万hm2，蚕茧产量分别达40.44万和37.4万t[2-3]。但广西桑园管理普遍存在盲目施用氮肥而导致的氮、磷、钾肥施用比例失调等问题，不仅造成桑园土壤肥力下降，而且引起桑园土壤健康状况失衡致使桑叶产量下降和品质劣化，严重制约广西桑蚕产业的可持续发展[3]。秸秆还田不仅有助于提升土壤肥力，还能有效减少化肥施用量和提高农产品品质[4]。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在物质循环和能量转换中发挥着重要作用，是秸秆分解、转化及土壤中能量和养分循环的关键因素[5]。已有研究表明，秸秆覆盖还田可丰富小麦[6]、玉米[7]、水稻[8]和油菜[9]等作物的田间土壤肥力和真菌群落多样性，但目前秸秆还田技术尚未在南方桑园推广应用。因此，分析秸秆覆盖还田对桑园土壤真菌多样性的影响，对优化桑园施肥管理措施、保障桑园土壤健康及提升桑叶产量和品质具有重要意义。【前人研究进展】胡洪涛等[4]研究表明，与对照(CK)相比，油菜秸秆还田土壤中子囊菌门(Ascomycota)、结合菌门(Zygomycota)和壶菌门(Chytridiomycota)等真菌门的相对丰度明显增加，树粉孢属(Oidiodendron)、核盘菌属(Sclerotinia)、羊肚菌属(Morchella)、外囊菌属(Taphrina)、粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys)、隐球菌属(Cryptococcus)、湿伞属(Hygrocybe)、被孢霉属(Mortierella)和Occultifur的相对丰度均显著增加。梅沛沛等[9]研究表明，在酸性土壤上，以水稻秸秆粉碎后与土壤混匀再还田方式进行的秸秆还田有利于土壤中真菌数量增加及养分分解和转化速率提高，使各生育时期油菜植株生物量显著增加。Su等[10]研究发现，两季作物秸秆还田后，其土壤细菌和真菌的相对丰度分别增加1.9%和7.7%，与土壤硝化相关的细菌相对丰度得到提高，但链格孢属(Alternaria)的相对丰度降低。李鹏等[11]研究认为，水稻秸秆还田可显著增加田间土壤的真菌群体数量和多样性指数，还可促使土壤中富集具有较强纤维素分解能力的真菌(如青霉菌和曲霉菌)。张红等[12]研究结果显示，不同种类秸秆还田对微生物群落的影响存在差异，其中玉米秸秆还田土壤的微生物群落密度显著高于大豆秸秆。李月等[13]研究发现，长期秸秆还田配施化肥处理可显著增加弯孢菌属(Curvularia)、篮状菌属(Talaromyces)、赤霉菌属(Gibberella)、镰刀菌属(Fusarium)、被孢霉属、毛壳菌属(Chaetomium)和枝顶孢属(Acremonium)的相对丰度，相对丰度的增加对改良农田土壤生态环境意义重大。纪程等[14]研究发现，秸秆还田可提高稻麦轮作土壤中子囊菌门及裂壳菌属(Schizothecium)、帚枝霉属(Sarocladium)、赤霉菌属、囊根壶菌属(Rhizophlyctis)、漆斑菌属(Myrothecium)和隐球菌属(Cryptococcal)等潜在秸秆降解真菌的相对丰度，还能通过富集潜在秸秆降解真菌加速麦秆降解。但也有研究结果显示，新鲜秸秆还田会对土壤健康产生负面影响，对作物品质和产量提高产生限制作用[1]。因此，科学的秸秆还田应避免采用新鲜秸秆还田方式。【本研究切入点】至今，尚缺乏秸秆覆盖还田对桑园土壤真菌群落影响的研究报道。【拟解决的关键问题】基于高通量测序技术，对比分析秸秆覆盖还田桑园和非秸秆覆盖还田桑园土壤真菌的多样性，评价秸秆覆盖还田技术对桑园土壤健康的作用机制，为优化桑园施肥管理措施、保障桑园土壤健康及构建可持续发展的桑树栽培管理技术体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及试验材料

试验于2020年5月3日至6月18日在广西大学农学院蚕桑教学实习基地(东经108°17′14″，北纬22°51′17″)进行，该基地土壤类型为赤红壤，pH 5.79，含有机质6.75 g/kg、全氮0.84 g/kg、全磷0.53 g/kg、全钾14.54 g/kg、碱解氮57.45 mg/kg、速效磷3.39 mg/kg和速效钾81.77 mg/kg。供试桑树品种为桂桑12号，树龄6年，采集其根区土壤样品为试验材料。

1.2 试验设计

采用随机区组设计，设秸秆覆盖还田桑园(SR)和非秸秆覆盖还田桑园(CK)2个处理。其中，SR处理是将干燥水稻秸秆切碎后直接覆盖于桑树根部的土面上，CK除未进行秸秆覆盖外，其余田间管理措施与SR处理相同。每个小区处理面积15 m2，6次重复。秸秆覆盖还田期间，平均气温约22 ℃，雨热同期。处理45 d后(2020年6月18日)分别采集SR处理和CK桑园0～30 cm土层的土壤样品。每处理随机选择6个土壤取样点，土样用无菌密封袋收集后放入冰盒带回实验室，置于-80 ℃冰箱保存。干冰保存送至测序公司提取DNA，进行高通量测序。

1.3 土壤真菌高通量测序

DNA抽提和PCR扩增：参照Fast DNA®SPIN Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，U.S.)操作说明进行土壤总DNA抽提，使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo fisher ccientific，美国)检测DNA浓度和纯度，以1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，并以提取的土壤微生物DNA为模板，选用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)为引物对真菌ITS区进行PCR扩增。使用常规方法回收PCR产物，并进行纯化和检测定量。

Illumina MiSeq测序：将同一样本的PCR产物混合后以2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen biosciences，Union City，CA，美国)进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测后用QuantusTMFluorometer(Promega，美国)对回收产物进行检测定量。基于Illumina MiSeq平台标准操作规程，以纯化后的扩增片段构建文库。利用Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

1.4 土壤真菌群落结构分析

土壤真菌群落结构分析包括土壤真菌的Alpha多样性分析、门分类水平分析、属分类水平分析、SR处理对桑园土壤真菌群落结构的影响和真菌FUNGuild功能预测。原始测序序列利用Trimmomatic进行质控；使用FLASH进行拼接，设置50 bp的窗口，去除质控后长度低于50 bp的序列，根据重叠碱基Overlap将两端序列进行拼接，根据序列首尾两端的Barcode和引物将序列拆分至每个样本；使用UPARSE version 7.1(http://drive5.com/uparse/)根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体，生成OTU表格；利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对ITS数据库，设置分类置信度为0.7。获得分类学信息和各样本在各分类水平上的群落组成，用图形进行可视化表示，使用Usearch和Mothur分别进行OTU丰度和Alpha多样性计算，得到样品物种信息；以LEfSe根据分类学组成对样本按照不同的分组条件进行线性判别分析(LDA)，找出对样本划分产生显著性差异影响的群落或物种；利用FUNGuild，根据真菌群落对同类环境资源的利用途径进行功能预测。

1.5 统计分析

试验数据采用Excel 2019进行统计，以SPSS 21.0进行方差分析，以Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验，并利用上海美吉生物医药科技有限公司的生信云分析平台(https://cloud.majorbio.com)进行在线数据分析。

2 结果与分析

2.1 秸秆覆盖还田土壤真菌的Alpha多样性

由表1可知，桑园土壤样品的覆盖率均在99.0%以上，说明分析数据真实可信；SR土壤中，指示真菌丰富度的Ace指数和Chao1指数均高于CK土壤，但二者间无显著差异(P>0.05，下同)；指示真菌多样性的Shannon指数以CK高于SR土壤，但二者间也无显著差异。说明秸秆覆盖还田未改变桑园土壤真菌的多样性和丰富度。

2.2 桑园土壤真菌群落结构组成分析

2.2.1 门分类水平的分析结果在门分类水平，将相对丰度占比大于1.00%的真菌门类定义为优势真菌门。从图1可看出，SR处理土壤的优势真菌门类分别为子囊菌门(Ascomycota,83.00%)、担子菌门(Basidiomycota，11.83%)、被孢霉门(Mortierellomycota，2.60%)和unclassified_k__Fungi(2.02%)，CK土壤的优势真菌门类分别为子囊菌门(58.79%)、担子菌门(21.93%)、unclassified_k__Fungi(11.83%)、被孢霉门(4.09%)和球囊菌门(Glomeromycota，2.69%)。其中，子囊菌门、担子菌门、被孢霉门和unclassified_k__Fungi是SR处理和CK土壤中的共有优势真菌门类，而子囊菌门具有降解纤维素和木质素的能力，可通过降解纤维素和木质素为桑树健康生长提供所需的营养和肥力。

表1 秸秆覆盖还田土壤真菌的多样性和丰富度

2.2.2 桑园土壤真菌属分类水平分析结果在属分类水平，将相对丰度占比大于1.00%的真菌属定义为优势真菌属。从图2可看出，SR处理和CK土壤中相对丰度占比大于1.00%的优势真菌属数分别为23和21个。其中，SR处理土壤优势真菌属为unclassified_f__Microascaceae(10.62%)、Apiotrichum(8.37%)、木霉属(Trichoderma，6.45%)、unclassified_o__Hypocreales(5.25%)、镰刀菌属(Fusarium，5.23%)、腐质霉属(Humicola，4.83%)、Plectosphaerella(4.20%)，Chordomyces(4.18%)、曲霉属(Aspergillus，4.12%)、新赤壳属(Neocosmospora，3.93%)、Roussoella(3.62%)、篮状菌属(Talaromyces，3.57%)、Gibellulopsis(3.17%)、被孢霉属(Mortierella，2.53%)、unclassified_o__Pleosporales(2.05%)、unclassified_k__Fungi(2.02%)、杯盘菌属(Ciboria，1.67%)、unclassified_c__Sordariomycetes(1.42%)、支顶孢属(Acremonium，1.35%)、unclassified_p__Ascomycota(1.31%)、毛孢子菌属(Trichosporon，1.23%)、毛壳菌属(Chaetomium，1.11%)、假埃希氏菌属(Pseudallescheria，1.09%)和其他(others)(14.97%)；CK土壤优势真菌属为Saitozyma(14.71%)、unclassified_k__Fungi(11.84%)、木霉属(8.36%)、unclassified_c__Eurotiomycetes(4.83%)、镰刀菌属(4.27%)、新赤壳属(3.98%)、篮状菌属(3.86%)、被孢霉属(3.39%)、毛壳菌属(2.89%)、Sistotrema(2.63%)、Gibellulopsis(2.40%)、unclassified_c__Sordariomycetes(2.15%)、Roussoella(1.73%)、青霉属(Penicillium，1.68%)、unclassified_o__Xylariales(1.38%)、unclassified_p__Ascomycota(1.37%)、马利亚霉属(Mariannaea，1.37%)、Chordomyces(1.35%)、unclassified_o__Pleosporales(1.35%)、Plectosphaerella(1.13%)、粉褶菌属(Entoloma，1.02%)和其他(others)(20.33%)。可见，秸秆覆盖还田可使桑园土壤的优势真菌群落相对丰度占比发生改变，其中，缺失Saitozyma，unclassified_c__Eurotiomycetes、Sistotrema、青霉属、unclassified_o__Xylariales、马利亚霉属和粉褶菌属等优势真菌属，但富集unclassified_f__Microascaceae、Apiotrichum、unclassified_o__Hypocreales、腐质霉属、曲霉属、杯盘菌属、支顶孢属、毛孢子菌属和假埃希氏菌属等特有优势真菌属，而腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)和支顶孢属(Acremonium)等秸秆降解真菌的富集有利于加速秸秆降解，保障桑树植株土壤养分均衡供给，有利于桑树健康生长发育。

2.3 秸秆覆盖还田对桑园土壤真菌群落结构的影响

物种进化分支图(图3-A)可从内圈到外圈依次展示样本群落中从门到属的所有等级关系及各分类单元在不同处理间的差异情况。基于LDA值分布柱状图(图3-B，筛选标准为P<0.05，LDA score>4.0)可知，在门分类水平，子囊菌门真菌是SR处理土壤中相对丰度占比最大的优势真菌门类，unclassified_k__Fungi和球囊菌门是CK土壤中相对丰度占比前2位的优势真菌门类；在属分类水平，unclassified_f__Microascaceae、Apiotrichum、unclassified_o__Hypocreales和腐质霉属是SR处理土壤中相对丰度占比排名前4位的优势真菌属，Saitozyma、unclassified_k__Fungi和unclassified_c__Eurotiomycetes是CK土壤中相对丰度占比排名前3位的优势真菌属。说明秸秆覆盖还田处理土壤中子囊菌门和腐质霉属等秸秆降解真菌的相对丰度占比明显增加，从而有利于加速秸秆降解，为桑树生长发育提供所需的营养和肥力。

2.4 真菌FUNGuild功能预测

利用FUNGuild，根据真菌群落对同类环境资源的利用途径进行功能预测。从图4可看出，SR处理和CK土壤的真菌可划分为共生营养型(Symbiotroph)、病理营养型(Pathotroph)和腐生营养型(Saprotroph)3种类型及15个Guilds，其中，主要包括植物病原真菌(Plant pathogen)、未定义腐生菌(Undefined saprotroph)、不明真菌(unknown)、土壤腐生真菌(Soil saprotroph)、凋落物腐生真菌(Litter saprotroph)、粪腐真菌(Dung saprotroph)、体表寄生菌(Epiphyte)、植物腐生真菌(Plant saprotroph)、地衣寄生真菌(Lichen parasite)、木质腐生真菌(Wood saprotroph)、寄生真菌(Fungal parasite)、动物病原菌(Animal pathogen)、丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal)、外生菌根(Ectomycorrhizal)和内生真菌(Endophyte)。可见，与CK相比，秸秆覆盖还田桑园土壤中富集了相对丰度更为丰富的腐生营养型真菌，更有利于提高土壤肥力，促进桑树生长。

3 讨论

秸秆覆盖还田具有培肥、蓄水、调温、增产及减少污染等作用，能有效改善农田生态环境、培肥地力和提高作物品质与产量。因此，在我国南方桑园开展秸秆覆盖还田技术研究，对构建稳定高产、可持续发展的桑树栽培管理体系具有重要意义[1]。植物根系、土壤及土壤根际微生物所形成的根际微生态系统通常维持着动态平衡[8]。微生物是生态系统中功能活跃并具有开发潜力的宝贵生物资源库[15]。土壤中丰富的微生物多样性在陆地生态系统中发挥非常重要的功能，微生物群落多样性越丰富、物种越均匀、群落结构越稳定时，植物对抗病原菌的综合能力就越强[16]。王妍[17]研究发现，免耕秸秆还田、焚烧秸秆还田和火粪秸秆还田对土壤真菌丰富度指数和多样性指数均无显著影响。本研究亦发现，秸秆覆盖还田下指示桑园土壤真菌丰富度的Ace和Chao1指数及指示真菌多样性的Shannon指数与非秸秆覆盖还田桑园相比均无显著差异。

已有研究证实，子囊菌能降解纤维素和木质纤维素[5，18]；麦秆还田后土壤的优势真菌门类主要为子囊菌门、接合菌门和担子菌门[17-19]；无论是短期的培养试验还是长期的定位试验，秸秆还田后子囊菌门真菌的相对丰度均显著增加[20-21]。本研究同样发现，在门分类水平，子囊菌门和担子菌门真菌是秸秆覆盖还田桑园土壤的优势真菌门类，秸秆覆盖还田桑园土壤中子囊菌门真菌的相对丰度显著高于非秸秆覆盖还田桑园土壤。

本研究结果表明，在属分类水平，Saitozyma、unclassified_c__Eurotiomycetes、Sistotrema、青霉属、unclassified_o__Xylariales、马利亚霉属和粉褶菌属等均为非秸秆还田桑园土壤特有的优势真菌属，unclassified_f__Microascaceae、Apiotrichum、unclassified_o__Hypocreales、腐质霉属、曲霉属、杯盘菌属、支顶孢属、毛孢子菌属和假埃希氏菌属等是秸秆覆盖还田桑园土壤特有的优势真菌属。杨顺等[22]研究表明，曲霉属真菌具有溶磷、促生长作用，腐质霉属真菌具有降解纤维素和木质纤维素促进植株根系吸收养分、保障植株根际土壤养分均衡供应微环境作用[23]，支顶孢属真菌具有较高的纤维素酶分泌能力[24]和强化宿主植株根际微环境生防能力[25]。本研究中，秸秆覆盖还田桑园土壤富集了相对丰度占比更高的子囊菌门真菌及腐质霉属、曲霉属和支顶孢属等特有优势真菌属，表明秸秆覆盖还田能通过富集潜在秸秆降解真菌加速秸秆降解，保障桑树植株土壤养分均衡供给，有利于桑树健康生长发育。