南瓜实蝇气味结合蛋白基因鉴定及组织分布

孔 琼，王传铭，汪斌伟，张晓媛，李 珣，谢 昆，舒 茜，黄镜梅，袁盛勇

(红河学院生物科学与农学学院/云南省高校滇南特色生物资源研究与利用重点实验室，云南 蒙自 661199)

【研究意义】南瓜实蝇[Bactroceratau(Walker)]是一种重要的农业检疫性害虫，分布于东南亚和南太平洋地区[1]，而中国主要分布于东南沿海、华中、华南、西南等地区。寄主范围广，能危害16个科80多种植物，尤其是果蔬类作物，会造成巨大的经济损失。目前该虫仍以化学防治为主，带来一系列不良后果，如环境污染加重、果蔬农药残留超标和害虫易产生抗药性等[2-4]。所以，基于嗅觉靶标的防治策略制定具有重要意义，即通过调控其觅食、产卵等行为进行害虫防治是一个重要的研究方向，开发绿色、环保、安全的新型昆虫行为干扰剂，并为南瓜实蝇的后期相关研究提供理论基础。【前人研究进展】昆虫嗅觉感受器是昆虫感受外界挥发性化学物质的特异感受系统，昆虫通过该系统感知和识别气味分子，并将其转化为电生理信号，从而调控昆虫对外界信息化学物质做出反应，如取食、交配、产卵及躲避敌害等行为[5-6]。而这一序列过程，需要多种蛋白参与，包括气味结合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、化学感受态蛋白(chemosensory proteins，CSPs)、气味受体蛋白(odorant receptors，ORs)、气味降解酶(odorant degrading esterase，ODEs) 、离子型受体(ionotropic receptors，IRs) 以及感觉神经元膜蛋白 (sensory neuron membrane proteins，SNMPs)等，且每种蛋白都不可替代，发挥着重要作用[7-8]。其中OBPs是气味分子和受体间的桥梁，起到识别并运输气味分子，激活受体，降解和保护等主要功能，在昆虫嗅觉通讯中具有重要作用[7,9]。目前，气味结合蛋白(OBPs)在多种昆虫中被鉴定出来，如鳞翅目稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)[10]、大蜡螟(Galleriamellonella)[11]、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)[12]；直翅目亚洲小车蝗(Oedaleusasiaticus)[13]、沙漠蝗(Schistocercagregaria)[14]；鞘翅目马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)[15]、云南切梢小蠹(Tomicusyunnanensis)[16]；膜翅目斑痣悬茧蜂(Meteoruspulchricornis)[17]；双翅目柑橘大实蝇(Bactroceraminax)[18]、斑翅果蝇(Drosophilasuzukii)[19]；半翅目麦长管蚜(Sitobionavenae)[20]等。虽然OBPs是一类低分子量的水溶性蛋白，且具有相似的结构，但不同种昆虫其OBPs数量和组织表达差异较大[21]。【本研究切入点】前人关于实蝇科害虫桔小实蝇(B.dorsalis)、柑橘大实蝇(B.minax)、瓜实蝇(B.cucurbitae)等的OBPs鉴定、特征、组织表达及功能研究较多[18,22-23]，而南瓜实蝇(B.tau)的相关研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】通过南瓜实蝇转录组库和NCBI搜寻气味蛋白基因，对南瓜实蝇OBPs基因的cDNA全长序列进行克隆和分析，并采用半定量RT-PCR检测不同OBPs基因在其组织中的表达情况，以期明确南瓜实蝇OBPs 基因的特性、表达情况，为南瓜实蝇的后续相关研究和揭示昆虫嗅觉反应机制提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

虫源：南瓜实蝇采用人工饲养3代以上的实验室种群。成虫于26 ℃，相对湿度(75±10)%，光周期L∶D=14 h∶10 h下进行饲养。

主要试剂：Trizol 购自 Invitrogen公司；通用型RNA提取试剂盒(R4130-02)购自广州美基生物科技有限公司)；琼脂糖凝胶回收试剂盒、载体 pMD18-T和TOP10感受态细胞购自 TaKaRa公司；反转录试剂盒(HB181210)、Hieff®PCR Master Mix、三氯甲烷、琼脂糖、无水乙醇、DL2000 DNA Marker、loading buffer等一些常用试剂购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 南瓜实蝇OBP基因的克隆

1.2.1 引物设计 根据转录组测序结果注释筛选获得6条南瓜实蝇OBP基因，利用Primer premier 5.0设计扩增OBPs全长和RT-PCR的所用引物(表1)，引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 南瓜实蝇不同组织的RNA采用通用型RNA试剂盒提取，并采用反转录试剂盒进行cDNA合成，获得cDNA于-20 ℃保存备用，或直接用于克隆或RT-PCR。

1.2.3 南瓜实蝇OBP基因的克隆与鉴定 以cDNA为模板进PCR扩增，克隆OBPs的全长。体系为50 μL，组成为模板cDNA 2 μL、PCR Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL，反应条件为94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、50～58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃终延伸10 min，其中退火温度根据引物不同进行微调。将鉴定后的扩增产物连接至pMD18-T载体，并转化到TOP10感受态细胞中，培养后，挑起阳性单克隆菌株送至上海生工生物科技有限公司测序。测序结果利用DNASTAR 7.1软件中的SeqMan工具进行拼接分析，获得完整的基因编码区序列。

1.2.4 南瓜实蝇OBPs序列分析及系统进化树构建 利用在线程序ExPASy ProtParam获得OBPs编码氨基酸的数量、分子量、等电点等信息；再通过在线程序Open Reading Frame Finder预测OBPs序列的开放阅读框；用Vector NTI计算序列间的相似度；同时用SignalP 4.1在线软件进行信号肽预测；采用TMHMM工具分析蛋白质跨膜区；运用NCBI中的BLAST工具进行序列相似性搜索；采用MEGA 6.0软件的neighbor-joining(NJ)法(Bootsrap1000次)进行系统进化分析。

表1 南瓜实蝇OBPs 基因鉴定和组织表达分布所用引物

1.3 南瓜实蝇雌、雄虫中OBPs的组织表达分析

以南瓜实蝇雌、雄虫不同组织的cDNA为模板，β-actin为内参照基因，用表1中的半定量特异性引物进行扩增。反应体系(体积50 μL)为模板cDNA 2 μL、PCR Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL；反应程序为94 ℃ 预变性5 min、94 ℃变性30 s、50～57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃终延伸10 min。产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测目标条带。

2 结果与分析

2.1 南瓜实蝇OBPs克隆

用设计的6对特异性全长引物对南瓜实蝇OBP基因编码区进行扩增，获得大小为500～990 bp，与预测相符(图1)，可用于后续试验。

2.2 南瓜实蝇OBPs序列分析和鉴定

根据6对引物的特异性扩增和测序拼接后的序列，并利用 OBPs 保守半胱氨酸(Cys，cysteine)位点的特征序列鉴定南瓜实蝇OBPs，再利用 PSI-Blast 和关键词搜索进行比对鉴定，共获得6个OBPs，见表2。6个OBPs基因序列长度在498～955 bp，编码的氨基酸数量为128～314 aa，等电点于4.69～8.16，分子量大小为14.67～36.24 kDa，且每个OBP序列的N端均有具有16～26 aa组成的信号肽序列。其中OBP1编码314个氨基酸为超长链，相比其他的OBPs要长149～223 aa，而OBP2、OBP9、OBP11和OBP14为长链，编码的氨基酸分别为165、154、148和148个，OBP8则为中链，编码128 aa。

同时根据OBPs保守Cys残基数目和多序列比对发现南瓜实蝇OBPs具有典型的保守结构域，其中OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14等5个属于Classica型，均含有6个保守半胱氨酸位点；而OBP8的第2、5个保守半胱氨酸位点被其他氨基酸代替，在分类上属于Minus型(图2)。

2.3 南瓜实蝇OBPs的进化分析

通过南瓜实蝇6个OBPs序列间的相似度对比发现，不同序列间的相似性较低为30%～51%(表3)。其中OBP8和OBP9的氨基酸序列相似性最高达51%；OBP11和OBP14次之，为49%；OBP2和OBP9、OBP8和OBP11较低为40%；OBP1和OBP11的相似性最低为30%，表明6个南瓜实蝇OBPs在一定程度上具有同源性，也存在着较强的分化差异。

表2 南瓜实蝇OBPs基因序列分析

表3 南瓜实蝇6个OBP氨基酸序列的相似性

为了明确南瓜实蝇OBP与其他近缘种的进化关系，以南瓜实蝇OBPs氨基酸序列进行BLAST比对，并选取比对结果相似性大于70%且与南瓜实蝇OBPs相近的12种双翅目实蝇科昆虫共48个OBPs进行系统进化树构建(图3)。由图3可知，6个南瓜实蝇OBP分布在其他实蝇科昆虫的OBPs分枝上，没有特化形成单一分枝。其中OBP1、OBP2、OBP14聚于同一大进化分枝，又分别聚于不同的小进化枝(OBP1、OBP2聚于同一进化枝，OBP14单独为另一枝)，3个均为Classic型；OBP11单独分布在另一进化枝上，属于Classic 型；而OBP8、OBP9聚类在同一大类的进化分枝上，但是又分别聚于不同小进化枝上，且OBP9是Classic型，而OBP8是Minus型，结果表明它们之间具有一定的同源性，但又存在分化。与其他双翅目昆虫比对发现，6个南瓜实蝇OBPs与瓜实蝇(Zeugodacuscucurbitae)的OBPs亲缘关系较近，柑橘大实蝇(B.minax)次之；虽然不同OBPs之间分化程度明显，但相同OBPs亚家族仍然聚类到同一进化枝，表明其在进化过程中仍具有同源性。

2.4 南瓜实蝇雌、雄虫中OBPs的组织表达情况

采用半定量PCR对6个OBPs基因在南瓜实蝇的不同性别、成虫不同组织中的表达情况进行检测，从图4可看出，除OBP14在雄虫腹部组织不表达，且在雌虫头、足和腹部表达较少外，其余5个OBPs在雌、雄虫的不同组织中均有分布和表达。其中OBP1在雌雄虫的不同组织中均有表达和分布且表达量相对一致，OBP2在雄虫的触角、头、足和腹部组织中表达量相对较高且一致，而OBP8则在雌虫的触角、头、足和腹部组织中高度表达且量相对一致。因此OBP1、OBP2、OBP8、OBP9、OBP11 5个OBPs在雌、雄虫的触角、头、足和腹部等组织中广泛分布，而OBP11、OBP14均在雌、雄虫触角中高度表达。

3 讨 论

前人研究发现昆虫OBPs是一类水溶性的小分子蛋白，不同昆虫其体内鉴定出的数目多少不等且差异较大，不同属或种间其氨基酸序列差异较大，并且同一物种下不同OBP间的氨基酸同源性也较低[21,24-25]。如鞘翅目马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)鉴定出26个OBP，编码氨基酸长度为67～255 aa，各序列间高度分化，氨基酸序列相似性为3.20%～41.91%[15]；双翅目中的桔小实蝇(B.dorsalis)鉴定出49个OBP[26]；枣实蝇(Carpomyavesuviana)克隆出7个OBP，其开发阅读框长为372～510 bp，编码氨基酸长度为124～170 aa[27]；福建漳州的南亚实蝇(B.tau，南瓜实蝇)克隆鉴定出26个OBP[28]，且与瓜实蝇(B.cucuribitae)OBPs高度相似；而云南红河州的南瓜实蝇(B.tau)仅克隆鉴定出6个OBP，其编码的氨基酸长度为128～314 aa，各序列间高度特化，氨基酸序列相似性仅为3.20%～41.91%，并且不同OBP间其相似性较低为30%～51%，可能与采集地地理环境不同或者未完全鉴定出OBP有关，推测南瓜实蝇体内不同OBPs可能具有不同的生理功能。

根据OBPs中半胱氨酸残基位置和数目的不同，可将昆虫OBPs分为5类：①Classical，含有6个保守的半胱氨酸位点;②Minus，常含有4或5个半胱氨酸位点，其数目比Classical型少1～2个;③Plus，保守半胱氨酸数量大于6个，在第6个半胱氨酸后至少有2个额外的半胱氨酸和1个脯氨酸;④Atypical，含有多于6个半胱氨酸位点，但N端区域较为典型，C端区域较长且特征不明显;⑤Dimer，含有2个典型的半胱氨酸基序聚合在一起形成[25,29-31]。通过试验鉴定出的6个南瓜实蝇OBPs，有5个是Classical型，分别为OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14，均含有6个保守半胱氨酸位点；1个(OBP8)是Minus型，该基因的第2个、第5个保守半胱氨酸位点被其他氨基酸代替。南亚实蝇(B.tau，南瓜实蝇)鉴定出的26个OBPs中Classical型有21个，Dimer型1个，Minus型和Plus型各2个[28]；桔小实蝇(B.dorsalis)注释获得49个OBPs，其中33个属于Classical型，4个属于Plus，10个属于Minus，仅有2个属于Atypical型[26]；枣实蝇(Carpomyavesuviana)转录组获得7个OBPs，其中5个是Classical型，其余2个是Minus型[27]。因此不同科属或同属不同种的昆虫体内的OBPs数目、类型和比例差异较大。OBPs可在昆虫的不同组织中表达，如头、胸、腹、翅、下颚须、喙、口器、性腺、精囊、气门等[21]，同时在昆虫的唾液中也有表达[31]。但同种昆虫OBP在不同性别的成虫组织中表达量差异较大[9,21]，本文研究也有类似的结果，即南瓜实蝇(B.tau)的5个OBP1、OBP2、OBP8、OBP9、OBP11在雌、雄虫的触角、头、足和腹部等组织中广泛分布，而OBP14在雌虫的腹部不表达，因此腹部可能不是南瓜实蝇气味结合蛋白作用的重要部位。

通过鉴定获得6个南瓜实蝇OBP及其相关的生物信息学数据，但这些基因在虫体内的作用，还需进一步进行表达和纯化，并采用荧光竞争结合、免疫组学、亚细胞定位及RNA沉默[32]等试验对OBP的具体功能深入研究，才能为开发南瓜实蝇绿色、有效引诱剂提供科学依据，同时为后期研究南瓜实蝇的嗅觉功能提供理论基础。

4 结 论

克隆并鉴定出的6个南瓜实蝇OBPs基因，长度介于498～955 bp，编码128～314 aa，其中OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14属于Classic型，而OBP8属于Minus型，且6个OBPs分化明显，相似度为30%～51%；6个OBPs在雌、雄虫不同组织中均有表达，而OBP14在雄虫腹部不表达，OBP15在雌虫腹部不表达。数据的获得将为进一步研究南瓜实蝇嗅觉识别分子机制和引诱机制奠定基础。