贝壳杉烯酸诱导烟草的系统获得性抗性防御番茄斑萎病毒侵染

2021-02-12赵立华杨婷婷邱润霜何思洁张丽珍张仲凯

西南农业学报 2021年12期

赵立华，杨婷婷,2，邱润霜，何思洁,2，余萍，郑雪，张丽珍，张仲凯*

(1.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业农村部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南昆明 650205；2.西南林业大学园林园艺学院，云南昆明 650224)

【研究意义】番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)在世界范围内广泛发生分布，为害多种作物引起严重的经济损失，因其经济重要性和科学重要性被列为世界十大病毒之第2位[1]。TSWV近年来已在中国18个省(区、市)快速发生蔓延，严重危害番茄、辣椒、烟草、莴苣、葫芦科等作物。1997年，根据感病植株叶部组织的电子显微镜观察，在云南烟草中首次发现了疑似TSWV的病毒粒体;2010年，基于核壳体蛋白N基因测序及其推导的氨基酸序列分析正式报道云南烟草中发现TSWV[2-3]。TSWV是正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的代表种，属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)，其中Orthotospovirus是唯一侵染植物的属[4]。TSWV通过蓟马传播，且能在蓟马体内复制增殖，西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)是中国云南TSWV的主要传播介体[5]。TSWV是目前已知寄主范围最广的植物病毒，侵染番茄(Solanumlycopersicum)、烟草(Nicotianatabacum)、辣椒(Capsicumannuum)、南瓜(Cucurbitamoschata)、芹菜(Celerycoriandrumsativum)和豇豆(Vignaunguiculata)等84科1000多种植物，给农业生产造成了严重的经济损失[6-11]。由于抗病品种缺乏与病毒突变、重组产生新株系等原因，目前对TSWV引起的病害尚无特效的防控方法，生物源抗病毒诱导剂是近年来病毒病防控的重要途径之一。笔者拟在前期研究基础上探明贝壳杉烯酸(Kaurenic acid,3α-Angeloyloxy-9β-hydroxy-ent-kaur-16-en-19-oil acid,AHK)对TSWV侵染烟草诱导系统获得抗性的抑制机制，为生物源抗病毒农药研发筛选先导化合物。【前人研究进展】决明子(Cassiaobtusifolia)中分离的酚类化合物、肿柄菊(TithoniadiversifoliaA.Gray)中提取的倍半萜类化合物Tagitinin C和1β-methoxydiversifolin-3-0-methyl ether、桂皮(Cortexcinnamomi)、石蒜(Lycorischinensistraub)和百部(Stemonajaponica)中分离的生物碱类、石斛(Dendrobiumnobile)中分离的多糖等多种活性化合物具有抑制烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)侵染的活性[12-17]。三裂蟛蜞菊中提取的桉烷内脂类和二萜类化合物能通过提高PAL等生物防御酶活性抵御TMV侵染[18]。肿柄菊中提取的倍半萜类化合物Tagitinin A和三裂叶蟛蜞菊(Wedeliatrilobata)中提取的AHK能通过诱导JA通路抑制TSWV侵染[16,19-20]。其中，AHK在对TSWV接种烟草前后处理均有抑制效果，抑制率分别为62.40%、76.50%，超过对照农药宁南霉素[20]。【本研究切入点】通过AHK在TSWV接种烤烟品种K326(Nicotianatobacumcv K326)前、后处理，检测与系统抗性相关的酶活性与代谢通路关键转录因子基因的表达量，探索AHK诱导寄主植物对TSWV侵染的抑制机制。【拟解决的关键问题】明确AHK诱导寄主植物系统获得抗性抑制TSWV侵染的关键酶及其活性变化以及主要代谢通路的关键转录因子基因，为揭示其防御机理、研发生物源抗病毒诱导剂积累基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通烟烤烟主栽品种K326和TSWV毒源(TSWV-YN)，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所植物病毒实验室保存。化合物贝壳杉烯酸(AHK)，由中国科学院昆明植物研究所李顺林研究员提供。二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)购自SbaseBio生物公司。

1.2 试验方法

1.2.1 防控实验选择生长一致的5～6叶期健康烟苗，先摩擦接种 TSWV，10 min后用清水冲洗，24 h后再均匀涂抹AHK (200 μg/mL)，10 min后用清水冲洗；阳性对照为先摩擦接种 TSWV，24 h后涂抹双蒸水(ddH2O)；阴性对照为先涂抹ddH2O，24 h后涂DMSO。实验样品设3个重复，实验重复3次。

1.2.2 预防实验选择生长一致的5～6叶期健康烟苗，先均匀涂抹化合物AHK(200 μg/mL)，10 min后用清水冲洗，6 h后摩擦接种 TSWV，10 min后用清水冲洗；阳性对照为先涂抹ddH2O，6 h后接种TSWV；阴性对照为先涂抹ddH2O，6 h后涂抹二甲基亚枫(DMSO)。实验样品设3个重复，实验重复3次。

1.2.3 烟草抗病性相关的关键酶活性测定选择生长一致的5～6叶期健康烟苗，分别进行预防实验和防控实验，于0、1、2、3、4和5 d采取接种叶样品进行检测。按照试剂盒说明书(北京索莱宝科技有限公司，中国)分别提取苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和SOD，用分光光度计测定PAL、POD 和SOD分别在290 、470和 560 nm的吸光值(OD值)，按照试剂盒所给公式计算酶活。每组样品设置5个重复。

1.2.4 烟草防御相关蛋白基因的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR) 检测寄主相关防御基因复制量变化。根据试剂盒TriPure Isolation Reagent (Roche Diagnostics GmbH公司，美国)的说明从烟叶中提取总 RNA，按照反转录试剂盒TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金公司)的操作将上述提取的总RNA反转录完成第1链 cDNA 的合成，RT-qPCR检测按照FastStart Universal SYBR Green Master(Box)(Roche Diagnostics GmbH公司,美国)设定反应体系及反应条件。本研究用到的引物列于表1。用含有相应基因序列的质粒 DNA 建立标准线，按照10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀释标准样品。

表1 用于烟草防御相关蛋白基因的RT-qPCR检测引物

2 结果与分析

2.1 AHK对抗病相关酶活性的影响

2.1.1 AHK对PAL活性的影响单一AHK处理可以诱导烟草PAL酶活性升高，在处理后第1和3天活性达到高峰(图1-A，1-B)，在防控作用(TSWV+AHK)和预防作用(AHK+TSWV)中PAL活力在第2天达到高峰。TSWV+AHK处理后到第4天PAL活力一直低于AHK处理，在阳性对照(只涂抹TSWV)和空白对照(只涂抹DMSO)中PAL活性低于AHK和TSWV+AHK处理(图1-B)，结果表明AHK本身能诱导PAL活性升高，但只在预防作用中抵御TSWV侵染起到一定的作用。

2.1.2 AHK对POD活性的影响 AHK可以诱导过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性升高，在防控作用(TSWV+AHK)和预防作用(AHK+TSWV)中POD活力虽然有所升高，但低于对照AHK处理，阳性对照(只涂抹TSWV)和空白对照(只涂抹DMSO)中POD活力处于低水平状态(图1-C，1-D)，结果表明AHK本身能诱导POD活性升高，但在预防作用和防控作用中抵御TSWV侵染时未起到明显作用。

2.1.3 AHK对SOD活性的影响 AHK可以诱导超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)在处理后第1和4天活性达到高峰，在防控作用(TSWV+AHK)和预防作用(AHK+TSWV)中SOD活力在第2天达到高峰且SOD活力高于AHK处理，在阳性对照(只涂抹TSWV)和空白对照(只涂抹DMSO)中SOD活性低于AHK、TSWV+AHK及AHK+TSWV处理(图1-E，1-F)，结果表明AHK本身能诱导PAL活性升高，且在预防作用和防控作用中抵御TSWV侵染起到积极作用。

2.2 AHK对诱导SAR转录因子关键基因表达量的影响

2.2.1 AHK对接种叶中相关基因表达量的影响采用荧光定量RT-qPCR方法测定PR1a、PR1b、MYC2、NAC4个基因在接种叶中表达量。阴性对照(DMSO)的PR1a基因在0.5 h表达量达到高峰(图2-A)，对照(DMSO)的PR1b、NAC基因在1 h表达量达到高峰，AHK处理和阳性对照(TSWV)接种叶中PR1a、PR1b、NAC基因表达量低于阴性对照(DMSO)(图2-B，2-D)。AHK处理后MYC2基因表达量在1 h达到高峰，阳性对照(TSWV)和阴性对照(DMSO)中MYC2基因表达量一直处于低水平状态(图2-C)。结果表明AHK在接种叶中主要诱导了MYC2基因表达量升高。

2.2.2 AHK对接种叶中相关基因表达量的影响系统叶(接种叶上一叶)中防御基因表达量的变化能进一步说明AHK通过诱导寄主的系统抗性抵御TSWV侵染。采用荧光定量RT-qPCR方法测定PR1a、PR1b、MYC2和NAC4个基因在接种叶中的表达量。AHK处理后PR1a、PR1b分别在第3和2小时达到高峰，且高于阳性对照(TSWV)和阴性对照(DMSO)(图3-A，3-B)。AHK处理后MYC2基因表达量在第3小时到达高峰，且高于阳性对照(TSWV)和阴性对照(DMSO)(图3-C)。NAC基因在AHK处理和阴性对照(DMSO)中表达量在第3小时达到高峰，但是DMSO中NAC基因表达量高于AHK处理(图3-D)。结果说明AHK不仅诱导接种叶中MYC2基因表达量升高，同时也诱导系统叶中MYC2基因表达量升高，MYC2是茉莉酸(Jasmonic acid，JA)信号通路的关键基因，因此AHK可能通过诱导JA通路抵御TSWV侵染。

3 讨论

3.1 天然产物诱导寄主植物酶活性增加对系统获得抗性增强的效应

在抵御病原微生物侵染的过程中PAL、POD 和 SOD 等生物防御酶发挥着重要作用。PAL 是苯丙烷代谢途径关键酶，能诱导作物的获得性系统抗性(Systemic acquired resistance,SAR)抵御病原微生物侵染[21]，POD可以催化H2O2还原，诱导SA、木质素和抗毒素的合成，引起植物的免疫应答，抑制病原菌的增殖[22]。SOD是生物体抗氧化系统第一道防线，能有效清除生物体内活性氧[23]。前人研究发现生物碱化合物、香菇多糖硫酸酯、硫脲化合物、桉叶内脂类化合物能通过提高寄主体内PAL、POD、SOD活性，增强植物对TMV的抵御能力[15,24-27]。本研究发现活性化合物AHK在防控作用和预防作用中主要诱导SOD活性升高，以此增强清除活性氧的能力，同时调节植物体内光合作用、呼吸作用等生理活动，诱导植物系统抗性抵御TSWV的侵染。

3.2 天然产物诱导寄主植物SA和JA信号通路对防御病毒侵染的抑制效果

病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)是植物受病原物侵染或非生物因子刺激后产生的一系列蛋白，通过诱导寄主的SAR有效抑制病原体的生长、繁殖和扩散[28-29]，研究表明PR蛋白家族中PR1与植物的SAR相关[30-32]。TSWV侵染能通过诱导寄主SA通路增强作物的基础抗性，本研究中发现TSWV侵染诱导了寄主SA通路关键基因PR1a和PR1b基因的表达，与前期研究结果一致[33]。NAC代表了一大类植物特异性转录因子，这些因子与生物的发育、衰老和防御相关，并且NAC转录因子参与JA信号通路[34-37]。本研究中NAC表达量有一定升高，说明NAC在化合物AHK诱导寄主抗性抵御TSWV侵染的过程中起到一定辅助作用。MYC2是JA通路的转录因子，MYC2转录因子与JAZ蛋白以及COI1基因通过ZIM结构域相互作用，当JA通路激活时，JAZ蛋白被26S蛋白酶体降解进而释放MYC2等转录因子使JA通路发挥作用[38]。本研究中AHK处理后接种叶和系统叶中都MYC2表达量相比于对照升高，AHK通过诱导SOD活性升高以及抗性相关转录因子表达量升高进而诱导寄主系统抗性抑制TSWV侵染，研究结果对研发新型抗病毒植物源药剂，实现病毒病的绿色防控奠定了理论基础。