基于网络药理学分析公英解毒洗剂溻渍治疗下肢静脉性溃疡的分子机制

刘国妍 刘 政 王颖蕊 王洪杰

1山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250013

2山东中医药大学附属医院周围血管病科，山东 济南 250014

下肢静脉性溃疡（venous leg ulcer，VLU）是常见的周围血管外科疾病，具有迁延不愈且愈合后又极易复发等特点，且慢性溃疡存在癌变可能，严重影响患者的生活质量[1]。VLU护理费用的增加同时加重了患者的经济负担[2]。研究显示，欧洲国家VLU人群发病率为1%，且随着年龄的增长，发病率增长至4%[3]，而在中国VLU人群发病率为0.06%～2.00%[1]。VLU在中医范畴中为臁疮。中医认为其病机是久立或负重久行，导致机体过度劳累，气血耗伤，中气下陷，以致下肢气血运行不畅，或形成恶脉，气血瘀滞于肌肤，复因损伤湿热之邪乘虚而入，发为疮疡，肌肤溃烂，经久不愈[4]。此病在发生发展过程中，虚、湿热、瘀、腐相互作用、互为因果，从而出现各种病证。而在治疗上，补虚可助邪，驱邪易伤正，单纯治法难以速效，故在臁疮的不同分期，以清热解毒、活血化瘀为治疗大法，或兼以化腐除湿，或兼以益气养血[5]。公英解毒洗剂是由蒲公英、苦参、黄柏、连翘、木鳖子、金银花、白芷等药物组成，具有清热解毒、祛腐排脓的功效。公英解毒洗剂广泛应用于治疗各类静脉性溃疡，前期临床研究证实，使用公英解毒洗剂溻渍疗法可改善VLU创面和创周的环境及微循环[6]，促进肉芽的生长[7]，加速创面愈合，同时减少患者痛苦。赵波[8]通过对VLU患者血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂-1、超敏C反应蛋白表达的动态监测，证实公英解毒洗剂具有较强的抗菌消炎作用，值得临床推荐。谢进等[9]通过临床试验发现公英解毒洗剂能够祛除疮面坏死组织，预防疮面感染，缩短疮面愈合时间。郝清智等[10]通过对公英解毒洗剂的临床疗效分析显示，公英解毒洗剂不仅可以促进疮面愈合，而且能够减轻患处的疼痛。网络药理学是通过构建和整合疾病-基因-靶点-药物之间相互作用的网络，进而对网络进行分析，从而系统观察药物对疾病网络的干预与影响，揭示多分子药物如何协同作用于人体[11]。本研究运用网络药理学的方法，从公英解毒洗剂的药物组成成分出发，着眼于整体分析公英解毒洗剂治疗VLU的分子机制，且为后续研究提供一定的理论支持，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 获取公英解毒洗剂活性成分及相关靶点信息

利用中药系统药理学分析平台（Tcmsp，http: //tcmspw.com/tcmspsearch.php）[12]对公英解毒洗剂中金银花、甘草、赤芍、白芷、木鳖子、牡丹皮、连翘、黄柏、苦参的活性成分进行检索，并以类药性（drug-like，DL）≥0.18为标准进行筛选，获得相关中药的有效活性成分后利用TCMSP获得其所对应的靶点。利用BATMAN-TCM数据库（http://bionet.ncpsd.org/batman-tcm）[13]获取蒲公英有效活性成分，并利用BATMAN-TCM数据库获得其所对应的靶点。为使靶点名称标准化，将两个数据库中获取的药物成分蛋白质靶点导入UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）[14]，取得官方基因名和UniProt ID，整理数据并筛除重复值后，所得结果即为公英解毒洗剂的预测靶点。将获取的活性成分与预测靶点导入Cytoscape 3.7.2软件[15]构建公英解毒洗剂药物-成分-靶点网络图，并利用Degree值筛选关键活性成分。

1.2 VLU靶点预测

在OMIM数据库（http://www.omim.org/）、DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）中以“venous leg ulcer”为关键词挖掘治疗VLU的潜在靶点。将获取的靶点利用UniProt数据库进行标准化，整理并去重后，所得靶点即为VLU的预测靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集后，取得公英解毒洗剂溻渍治疗VLU的靶点。为进一步明确靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（protein protein interaction，PPI），将获得的靶点导入STRING数据库（https://cn.stringdb.org/）[16]，并利用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析，使用cytoHubba插件[17]进行网络拓扑分析获取公英解毒洗剂溻渍治疗VLU的核心靶点。

1.4 基因本体和京都基因与基因组百科全书潜在作用靶点通路获取

Metascape数据库（http://metascape.org/gp/index.html）[18]是一个整合了基因本体（gene ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和UniProt等多个权威的数据资源，不仅能完成通路富集，还可以做基因相关的蛋白质网络分析和药物分析。将取得的交集靶点导入Metascape数据库，选定物种为“homo sapiens”，并设定P＜0.01，进行GO分析和KEGG通路富集分析。

1.5 关键成分靶点通路网络图

将取得的关键活性成分、靶点、通路导入Cytoscape 3.7.2软件制作公英解毒洗剂溻渍治疗VLU的关键药物-成分-靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 公英解毒洗剂活性成分与靶点

利用TCMSP数据库共提取到公英解毒洗剂中牡丹皮、甘草、赤芍、白芷、木鳖子、金银花、连翘、黄柏、苦参的活性成分共1347个，依据DL≥0.18为标准进行筛选，最终得到713个活性成分。包括牡丹皮36个、金银花90个、甘草206个、赤芍62个、白芷46个、木鳖子17个、连翘89个、黄柏71个、苦参96个，整理数据并筛除重复值后，最终获得648个活性成分。利用BATMAN-TCM数据库获得蒲公英有效活性成分共8个。所有有效活性成分通过UniProt数据库使靶点名称标准化，合并后删除重复值，最终获得263个药物靶点。

2.2 公英解毒洗剂药物-成分-靶点网络图

将公英解毒洗剂的活性成分与靶点导入Cytoscape 3.7.2软件中构建公英解毒洗剂药物-成分-靶点网络图，见图1。图中可见共994个节点，1832条边。依据活性成分的Degree值进行筛选，获得公英解毒洗剂的10个关键活性成分，分别为槲皮素（quercetin）、蒲公英赛醇（taraxerol）、蒲公英甾醇（taraxasterol）、胆碱（choline）、汉黄芩素（wogonin）、山奈酚（kaempferol）、黄连素（berberine）、黄芩素（baicalein）、花生酸（arachic acid）、熊果酸（ursolic acid）。

2.3 VLU相关靶点

在OMIM数据库、DisGeNET数据库中分别获得疾病靶点221个、341个，所有疾病靶点利用UniProt数据库标准化，整理数据并去重后，最终获得VLU疾病靶点525个。

2.4 公英解毒洗剂治疗VLU的PPI网络

将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集后，共获得解毒公英洗剂溻渍治疗VLU的靶点46个。分析采用STRING数据库获取靶点蛋白内部关系，并导入Cytoscape 3.7.2软件中进行可视化分析，见图2。利用Cytoscape 3.7.2软件中的cytoHubba插件并根据最大团中心性（maximum clique centrality，MCC）算法进行拓扑分析，此算法集合了11种拓扑分析方法和6种中心性分析方法，具有较高的准确性。用MCC算法所得靶点的分值越高，则其显著性越强，筛选出的10个关键靶点可能是公英解毒洗剂溻渍治疗VLU的关键靶点，分别为血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA；Degree＝16）、胰 岛 素（insulin，INS；Degree＝16）、白 细 胞 介 素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β；Degree＝14）、细胞肿瘤抗原p53（tumor antigen p53，TP53；Degree＝14）、血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecular 1，VCAM1；Degree＝12）、雌激素受体蛋白1（estrogen receptor 1，ESR1；Degree＝11）、激酶插入域受体（kinase insert domain receptor，KDR；Degree＝10）、Ⅰ型 胶 原α1链（collagen typeⅠalpha 1，COL1A1；Degree＝10）、基 质金 属 蛋 白 酶3（matrix metallopeptidase 3，MMP3；Degree＝9）、雄 激 素 受 体（androgen receptor，AR；Degree＝8）。

2.5 富集功能分析

将46个交集靶点导入Metascape数据库中，共获得54条富集通路。KEGG富集通路包括晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycosylation end products-receptor for advanced glycation end，AGERAGE）信号通路、癌症信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路等，共11条，见表1。

表1 公英解毒洗剂溻渍治疗VLU富集分析结果

富集功能分析条目显示，生物过程相关的条目最多，其中生物过程主要涉及细胞对外界刺激的反应（cellular response to external stimulus）、细胞对氮化合物的反应（cellular response to nitrogen compound）、对伤害的反应（response to wounding）、DNA结合转录因子活性的正调控（positive regulation of DNA-binding transcription factor activity）等，细胞组分主要涉及内质网内腔（endoplasmic reticulum lumen）、细胞膜膜筏（membrane raft）、细胞质膜外层（external side of plasma membrane）等；分子功能等涉及整合素结合（integrin binding）、蛋白酶结合（protease binding)、RNA 聚合酶Ⅱ基础转录因子结合（RNA polymerase Ⅱbasal transcription factor binding）等多个过程，见图3。以上数据提示，公英解毒洗剂的有效成分可能通过作用于这些通路发挥其治疗VLU的潜在作用。

2.6 公英解毒洗剂活性成分-核心靶点-通路

将公英解毒洗剂前10个关键活性成分、10个核心靶点及前11条富集通路导入CytoScape 3.7.2软件构建公英解毒洗剂活性成分-核心靶点-通路图，见图4。该图由41个节点、86条边组成。通过Degree值分析提示，槲皮素、蒲公英赛醇、蒲公英甾醇、胆碱等成分是重要活性成分，VEGFA、TP53、IL-1β等靶点是其重要靶点，AGE-RAGE信号通路、癌症信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路等是其重要通路，表明公英解毒洗剂是通过多成分、多靶点、多通路发挥治疗VLU的作用。

3 讨论

中医对于VLU还有“老烂腿”“裙边疮”等称谓。因其局部溃疡组织代谢缓慢、局部菌群失调而久不收口，且复发率高，故严重影响患者的生活。溻渍法自古有之，属于中医特色外治疗法，适用于各种类型的溃疡疮面[19]。现代医学证实此法可使药液直接作用于患处从而达到清热解毒、祛腐排脓的目的，还可在疮周形成湿润的环境，从而促进疮面的皮肤修复[20]。有研究表明，溻渍法治疗湿热下注型臁疮有较好的疗效[19]。目前临床上溻渍疗法已广泛应用于治疗各类疮面及皮肤病，简便易行，且疗效可靠，久用无不良反应[21]。

目前研究多在揭示VLU的损伤、炎性反应及修复机制，但其具体的发病机制仍不清楚[1]。现代医学认为VLU的发病主要由于静脉回流或功能不全的瓣膜反流和下腔静脉阻塞[22]导致静脉高压，持续的高压状态使血液动力学改变[23]，从而将炎性细胞和因子带入组织间隙，激活白细胞[24]，以及引发各种生物分子的释放最终引起溃疡的发生[25]。

公英解毒洗剂在VLU的治疗过程中的优势和特色明显[7]。前期临床研究表明，其有效率可达90%[26]，故对其药理机制的研究显得尤为迫切。分析公英解毒洗剂药物成分-作用靶点-疾病网络图，公英解毒洗剂治疗VLU的关键活性成分为槲皮素、胆碱、汉黄芩素、山奈酚、黄连素等。研究表明，槲皮素能降低白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的表达而达到抗炎作用[27]。胆碱的抗炎作用能抑制巨噬细胞释放肿瘤坏死因子，减轻全身炎性反应，且胆碱酯酶的抑制作用可激活胆碱能抗炎通路，从而减少炎性因子的产生[28]。汉黄芩素、黄芩素属于黄酮类化合物，目前针对其药理学的研究表明黄酮类化合物可缓解血管内皮细胞功能障碍[29]，并且分别作用于核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路的不同阶段，最终发挥抗炎作用[30]，从而降低血管疾病病死率。有研究证实，山奈酚可以通过减轻氧化应激反应和减低炎性标志物来预防血管损伤，提高溃疡愈合率[31]。黄连素具有抗氧化、抗炎等活性[32]，临床中已用于治疗多种疾病。此外，蒲公英赛醇、蒲公英甾醇可通过下调促炎介质的表达来实现其强大的抗炎作用[33-34]。花生酸可从蜂胶中提取，并有良好的抗炎镇痛效果[35]。药理学研究表明熊果酸存在于多种复方中药中，具有广泛的生物活性，如抗炎、抗变态反应、抗肿瘤等[36]。

网络药理学关键靶点分析发现，其中VEGFA、IL-1β、TP53等靶点与VLU关系密切，提示了公英解毒洗剂可能通过干预以上靶点而发挥治疗VLU的作用。VEGFA可由多种细胞分泌，是血管生成的主要驱动力[37]。现代研究表明巨噬细胞可通过增加VEGFA的表达来影响炎性反应的进程[38]。IL-1β可启动中性粒细胞的募集、促进成熟并增加血管的通透性，促进中性粒细胞和单核细胞向受损组织聚集，释放活性氧和基质金属蛋白酶，清除创面碎片、抑制细菌感染[39]，同时将骨髓间充质干细胞、角质形成细胞吸引到炎性部位，促进皮肤修复[40]。TP53蛋白是细胞内多种信号传导途径的连接点，对于细胞的增殖和凋亡有着重要的调控作用[41]。

富集分析结果表明，公英解毒洗剂治疗VLU的通路可能与AGE-RAGE信号通路、癌症信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路等通路有关。晚期糖基化终末产物在不同的组织有不同的致病机制，许多效应是通过结合相关受体而实现的，其与血管内皮表面的晚期糖基化终末产物受体结合后，可引起大量促炎细胞因子、生长因子和黏附因子等的表达和释放，从而影响溃疡的愈合进程[42]。此外，肿瘤坏死因子-α可通过癌症信号通路参与炎性过程并发挥作用。生长因子、炎性反应等刺激可激活丝裂原活化蛋白激酶信号的传导，从而引起细胞增殖和凋亡，参与疾病的发生发展[43]。

综上所述，公英解毒洗剂治疗VLU的主要成分可能是槲皮素、胆碱、汉黄芩素、山奈酚、黄连素等，治疗靶点主要包括VEGFA、IL-1β、TP53等，涉及到的关键通路有AGE-RAGE信号通路、癌症信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、缺氧诱导因子1信号通路等。公英解毒洗剂是通过多靶点、多通路联合作用来发挥其疗效的，为VLU的中医外治疗法提供了研究思路和理论基础。但本研究从网络药理学角度分析其可能的作用机制，具有一定的局限性，后期仍需通过动物实验进一步验证。