基于SSR标记和形态性状的杂交玉米特异性和多样性分析

姚宗泽，杨肖艳，杨昆红，段 忠*，赵自仙

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.大理州农业科学推广研究院，云南 大理 671005；3.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205；4.云南省绿色食品发展中心，云南 昆明 650032)

【研究意义】为探讨形态鉴定和SSR标记鉴定的差异，为玉米SSR标记鉴定规程的完善提供理论依据。目前在国内外，植物新品种DUS(特异性Distinctness、一致性Uniformity和稳定性Stability)测试采用的方法仍是田间种植测试，DUS测试指南的研制仍然是以农艺性状为基础。使得DUS测试存在着诸多问题[1-3]：测试周期长，人力物力投入大，易受病虫害的影响和季节限制。DUS测试指南中选用的性状多为数量性状，数量性状表现为连续分布，不容易分级[4]。玉米杂交种与自交系在形态性状上有显著差异，针对杂交种和自交系必须选用不同的标准，增加了测试的复杂性。理论上申请品种与近似品种之间存在差异，即申请品种是具有特异性的，但因为近似品种的选择有限，所以并不能推导出申请品种与所有已知品种有差异。对于育种工作者成功选育出一个新品种后，并不希望将其亲本详细系谱公布出去，但目前为了测试需要这一信息，育种者不得不提供该信息，不利于保护育种者权益。目前品种的数量越来越多，导致现有的性状指标不能满足品种特异性鉴定的需要[5]。同时，随着骨干亲本的集中利用，相似品种间的形态差异越来越小，专业技术人员在实际操作过程中经常会难以执行，从而延迟和阻碍了植物新品种授权以及仲裁等重大工作[6]。因此需寻求周期短、操作简单、不受季节环境影响、且测试的指标多、结果可靠的方法，来补充完善现有的DUS测试技术[4,7]。而DNA指纹技术就符合上述特点，能够补充形态学上的缺点[8-9]。【前人研究进展】DNA指纹技术是在21世纪发展起来的新技术，现已在基因定位、辅助选择育种、遗传多样性分析以及遗传图谱的构建等很多领域广泛应用[10-17]，但直接在DUS测试中应用的并不是很多。DNA分子技术的诞生和飞速发展，为DUS测试提供了更多的可能性，这些标记中SSR标记用于植物新品种测试是比较理想的。尽管当前分子标记尚未正式作为植物新品种判定的测试手段，但近年来，国际植物新品种保护联盟(UPOV)仍在鼓励各成员国要加快实现在分子标记技术标准化和数据库构建领域的研究[18]。当找到分子标记与性状表达之间的密切关联时分子标记技术就可以直接用于DUS测试，届时可以通过分子距离与形态距离相结合进行已知品种的管理，筛选近似品种时漏选的风险也会随之大大降低。目前我国大多数有关分子标记鉴定方面的研究成果仍处于报道层面，在植物新品种保护中的应用也仅限于近似品种的辅助筛选上[9,19]，目前仍未能取代形态学性状单独用于DUS测试中的特异性鉴定[18]。【本研究切入点】本研究先用姚宗泽等[20]筛选的20对核心引物，对45个杂交玉米品种进行特异性和多样性分析。同时，通过田间种植测试了45个杂交玉米品种的38个必测性状，基于形态性状对45个杂交玉米品种进行特异性和多样性分析。【拟解决的关键问题】综合比较分析形态性状鉴定法与SSR标记鉴定法，为以后玉米SSR标记鉴定规程的修订提供依据，为提高工作效率、加速品种鉴定提供可能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究共45个玉米杂交种(表1)，包括从云南市场上购买的22个杂交玉米品种和云南种业集团联合体提供的23个区试品种。本研究选用的20对SSR核心引物是由姚宗泽等[20]从玉米SSR标记鉴定规程推荐的引物中筛选而来。研究中的SSR鉴定部分于云南农业大学农学与生物技术学院五号楼6楼种质资源创新与利用实验室内完成，田间测试于楚雄州姚安县栋川镇大龙口村朱姓小组赵自仙教授的试验地上进行。

表1 45个杂交玉米品种编号、名称及来源

续表1Continued table 1

1.2 试验方法

1.2.1 SSR标记鉴定 具体操作过程参照玉米品种鉴定技术规程-SSR标记法中的方法步骤进行[21]。

1.2.2 SSR标记鉴定结果分析 特异性分析：根据每对引物扩增的多态性片段的分子量按从大到小排列，用“1”和“0”分别代表某一扩增片段的有与无，记录各玉米品种的等位基因类型。统计每两个杂交玉米品种间的差异位点数目，差异位点数目即2个品种间的分子差异值[22]，利用Excel 2017统计每两个杂交玉米品种间的分子差异值，材料编号从V01开始，按编号顺序依次统计每两个杂交玉米品种间的分子差异值，共计990个数。当分子差异值≥2，则判定为不同品种，即具有特异性；否则，判定为不具有特异性[21]。SSR遗传多样性分析和聚类分析：参照唐浩等[23-25]在水稻中的分析方法。

1.2.3 田间形态性状测试 田间试验设计与管理参照姚宗泽等[19]具体设计，性状的观测、判别与分级参考玉米DUS测试指南[26]及性状分级标准[27]进行，其中28个田间测试性状(表2)和10个室内测试性状(表3)。

表2 28个田间调查性状

表3 10个室内调查性状

1.2.4 田间测试结果分析 特异性分析：45个杂交玉米品种的38个必测性状测试之后，将每个品种每个性状测试结果按玉米DUS测试及性状分级标准[27]转为代码。将2个杂交玉米品种间每个性状代码之差绝对值的和记为2个品种间的形态差异值[22]，利用Excel 2017统计每2个杂交玉米品种间的形态差异值。从材料V01开始，按编号顺序依次统计每两个杂交玉米品种间的形态差异值，共记990个数，当形态差异值≥2，判定该品种具有特异性[26]。必测性状多样性分析和聚类分析：具体参照唐浩等[23-25]在水稻中的分析方法。

1.2.5 品种间分子差异与形态差异的比较分析 用45个杂交玉米品种的分子差异值与形态差异值进行比较分析,每种差异值均有990个数据，每个数据均是通过两个杂交玉米品种进行差异统计得出，将数据的排序直接记为对应的2个杂交玉米品种的组合序号，便于后续数据分析。参照张华生等[22]人的分析方法，以45个杂交玉米品种间的形态差异值为纵坐标，分子差异值为横坐标作散点图。

2 结果与分析

2.1 基于SSR标记的45个杂交玉米品种特异性鉴定分析

由表4可知，45个杂交玉米品种间的分子差异值为12～108，表明每两个杂交玉米品种间的差异位点均大于2，故45个杂交玉米品种均具有特异性。统计990组杂交玉米品种间的分子差异值，20对核心引物在45个杂交玉米品种中检测出平均每两个品种间的分子差异值为75.60，平均每对核心引物在两个杂交玉米品种间检测出3.78个分子差异值。

表4 45个杂交玉米品种间的分子差异值

续表4Continued table 4

续表4Continued table 4

2.2 基于形态性状测试的45个杂交玉米品种特异性鉴定分析

由表5可知，45个杂交玉米品种间的形态差异值为12～69，表明每两个杂交玉米品种间的代码差异均大于2，即45个杂交玉米品种均具有特异性。统计990组杂交玉米品种间的形态差异值，38个必测性状在45个杂交玉米品种中检测出平均每两个品种间的形态差异值为40.40，平均每个性状在两个杂交玉米品种间检测出1.06个形态差异值。

表5 45个杂交玉米品种间的形态差异值

续表5Continued table 5

续表5Continued table 5

2.3 SSR标记遗传多样性分析

由表6可知，20对SSR核心引物在45个杂交玉米品种中检测到218个等位变异，平均每对引物检测到10.90个，变幅为7～16个；平均Shannon-Weaver多样性信息指数为2.8922，变幅为1.6293～4.8211；平均有效等位变异为3.1600，变幅为1.2696～4.8252。

表6 20对SSR标记在45个杂交玉米品种中的多样性参数

表7 38个必测性状在45个杂交玉米品种中的多样性参数

图1 基于SSR分子标记的45个杂交玉米品种聚类结果Fig.1 Clustering results of 45 maize hybrid varieties based on SSR molecular markers

2.4 杂交玉米品种必测性状多样性分析

由表7可知，38个性状在45个玉米杂交种中检测到178个等位变异，平均每个性状检测到4.6842个，变幅为1～8个；果穗籽粒颜色数量(C33)多样性表现差异较大，果穗籽粒颜色数量(C33)在45个玉米品种中只出现1种，雄穗颖片除基部外花青甙显色强度(C10)则是8种，有效等位变异数目为5.9121，Shannon-Weaver多样性信息指数为1.9597。雄穗花药花青甙显色强度(C11)、雄穗侧枝与主轴夹角(C13)、雄穗侧枝弯曲程度(C14)和茎秆支持根花青甙显色强度(C21)在45个玉米品种中均出现7种等位变异，有效等位变异数目分别为4.2187、4.0644、4.0674、4.1666，Shannon-Weaver多样性信息指数分别为1.5544、1.6824、1.7406、1.5757。

图2 基于必测性状的45个杂交玉米品种聚类结果Fig.2 Clustering results of 45 maize hybrid varieties based on characteristics essential to be tested

只出现1种，所以没有对其进行多样性分析，其余37个性状平均Shannon-Weaver多样性信息指数为1.2593，变幅为0.4236～1.9982；平均有效等位变异为2.7830，变幅为1.0539～5.9121。不同性状的

图3 45个杂交玉米品种间分子差异值与形态差异值的散点图Fig.3 Scatter plot of molecular difference and morphological difference between 45 maize hybrid varieties

2.5 基于SSR标记的聚类结果

对45个杂交玉米品种进行聚类分析，结果如图1所示，45个品种间的相似系数为0.62～0.94。根据聚类结果可将其划分为3大类群：第Ⅰ类群有5个玉米杂交种，占11.1%；第Ⅱ类群有9个玉米杂交种，占20.0%；第Ш类群有31个玉米杂交种，占68.9%。

2.6 基于形态性状的聚类结果

对45个玉米品种进行聚类分析，结果如图2所示，45个品种间的形态相似系数为0.31～0.68。根据聚类结果可将其划分为3大类群：第Ⅰ类群包括5个玉米杂交种，占11.1%；第Ⅱ类群包括25个玉米杂交种，占55.6%；第Ⅲ类群包括15个玉米杂交种，占33.3%。

2.7 分子差异值与形态差异值的散点分布

由图3可知，同一组杂交玉米品种间的分子差异值要大于形态差异值，990个散点高度聚集在一起，中心坐标大概在(80，40)位置，其他散点紧密分布在中心坐标周围，有较少部分点零散分布在其他位置。

2.8 分子差异值与形态差异值的相关性分析

由图4可知，杂交玉米品种间的分子差异值随形态差异值的变化而变化，两条折线趋势高度一致，分子差异值与形态差异值之间呈极显著正相关。故可以通过两个杂交玉米品种间的形态差异值预测分子差异值，反之亦然。由折线图5可知，分子差异值与形态差异值的比围绕一个固定数值上下波动，但振幅不大，这个固定值约等于2。通过分析得出，平均分子差异值是形态差异值的1.9382倍。

图4 45个杂交玉米品种间分子差异值与形态差异值相关性分析Fig.4 Correlation analysis between molecular difference and morphological difference in 45 maize hybrid varieties

图5 45个杂交玉米品种间分子差异与形态差异的比值Fig.5 Ratio of molecular difference to morphological difference between 45 maize hybrid varieties

3 讨 论

在45个杂交玉米品种间，分子差异值为12～108，形态差异值为12～69，分子差异值大于形态差异值，张华生等[22]人也有类似的研究结果。但鉴定结果显示，45个杂交玉米品种均具有特异性，结果并无冲突。导致分子差异值较形态差异值高，可能是因为品种间的一些差异无法通过观察表型辨别。而且同一组材料不同技术人员进行辨别，其判定结果也可能有差异[9]。正如Smith等人[28-29]的观点，最理想的品种鉴定技术应该是具有较好的可操作性、精确性、可靠性和高度的自动化。从这一角度考虑，使用标准的分子标记技术进行特异性鉴定，判定结果可能更加稳定可靠，更接近真实存在，具有说服力。所以，加强和加快相关领域的研究迫在眉睫。

20对SSR核心引物在45个杂交玉米品种中共检测到218个等位变异，平均每个引物检测到10.90个，变幅为7～16；平均Shannon-Weaver多样性信息指数为2.8922，变幅为1.6293～4.8211；平均有效等位变异为3.1600，变幅为1.2696～4.8252。38个必测性状在45个杂交玉米品种中检测到178个等位变异，平均每个性状检测到4.6842个，变幅为1～8个；平均Shannon-Weaver多样性信息指数为1.2593，变幅为0.4236～1.9982；平均有效等位变异为2.7830，变幅为1.0539～5.9121。从多样性参数，可以看出，在45个杂交玉米品种间通过SSR标记分析的多样性要比形态鉴定结果丰富，与特异性鉴定结果保持一致。

通过SSR分子标记和形态性状2种分析，45个杂交玉米品种相似系数分别为0.62～0.94、0.31～0.68，聚类结果均可将45个杂交玉米品种划分为3大类群。云黄3号(V06)与地沃2号(V35)、卓玉6009(V25)与足单707(V30)在两种聚类结果中，均呈现有较高相似系数。SSR标记的聚类结果中，第Ι类群包括胜玉607(V09)、大天1号(V12)、益单518(V15)、贝玉001(V21)、宣瑞6号(V24)5个品种；形态性状的聚类结果中，该5个品种仍聚在一起，位于第П类群。形态性状的聚类结果中，第Ι类群包括水金玉1号(V04)、胜白玉2号(V11)、宣白玉2号(V19)、保玉7号(V37)、会单4号(V38)5个品种，该5个品种在SSR标记聚类结果中仍聚集在一起，位于第П类群。位于第Ш类群的杂交玉米品种，在两种结果中重合度较高。表明SSR标记鉴定和形态性状鉴定不同杂交玉米品种时，尽管结果不能完全一致，但特异性鉴定结果可信度比较高。黄婷等[30]人筛选出20对SSR引物，并分析得出SSR分子标记用于多花黑麦草品种鉴定具有可行性。

同一组杂交玉米品种间的分子差异值与形态差异值之间存在极显著正相关，分子差异值随形态差异值的增加而增加。由图5可以看出，分子差异值与形态差异值的比值是联系两者关系的关键。通过分析得出，平均分子差异值是形态差异值的1.9382倍。根据玉米DUS测试指南中判定玉米品种特异性的标准[26]和张华生[22]等人的研究，以形态差异值≥2可作为品种特异性判定标准。则分子差异值应为形态差异值的1.9382倍，即3.8764，故建议将SSR标记鉴定中分子差异值≥4，作为一个申请品种具有特异性的判定标准。

与形态性状鉴定相比，SSR标记鉴定有重复性好、判定结果客观、不易受环境条件及操作人员的影响等优点。虽然在品种鉴别中发挥重要作用，但目前分子标记鉴定仍未能取代形态性状鉴定，单独用于玉米品种DUS测试中申请品种的特异性鉴定。许多研究表明，分子标记与形态性状之间的相关性不够充分，本研究表明两者之间存在极显著相关，但相关系数只为0.27。说明即使品种DNA之间存在差异，但可能由于差异基因不参与表达或发生突变，导致表型之间没有差异。或者，两个品种间基因差异很小，但由于外界环境的影响，两者表型差异较大[9]。故本研究也不建议将SSR标记单独用于玉米品种的特异性鉴定。为保证新品种具有一定的自主创新，建议将分子差异值≥4作为玉米品种特异性的判定标准，即申请品种与近似品种间至少有4个差异位点，才能判定为不同品种。

4 结 论

45个杂交玉米品种分子差异值范围为12～108，20对核心引物在45个杂交玉米品种中检测出平均每两个品种间的分子差异值为75.60，平均每对核心引物在两个杂交玉米品种间检测出3.78个分子差异值。20对SSR引物在45个杂交玉米品种中共检测到218个等位变异，平均每个引物检测到10.90个，变幅为7～16个；平均Shannon-Weaver多样性信息指数为2.8922，变幅为1.6293～4.8211；平均有效等位变异为3.1600，变幅为1.2696～4.8252。45个杂交玉米品种间的相似系数为0.62～0.94，根据聚类结果，可将45个杂交玉米品种划分为三大类群。

45个杂交玉米品种形态差异值范围为12～69，38个必测性状在45个杂交玉米品种中检测出平均每两个品种间的形态差异值为40.40，平均每个性状在两个杂交玉米品种间检测出1.06个形态差异值。在田间种植的45个杂交玉米品种具有较丰富的形态变异，38个必测性状在45个杂交玉米品种中检测到178个等位变异，平均每个性状检测到4.6842个，变幅为1～8个；平均Shannon-Weaver多样性信息指数为1.2593，变幅为0.4236～1.9982；平均有效等位变异为2.7830，变幅为1.0539～5.9121。45个杂交玉米品种间的形态相似系数为0.31～0.68，根据聚类结果，可将45个杂交玉米品种划分为3大类群。两个杂交种间的分子差异值大于形态差异值，平均分子差异值是形态差异值的1.94倍，建议将SSR标记鉴定中分子差异值≥4，作为判定玉米申请品种具有特异性的标准。