基于microRNA 的心脏疾病临床治疗展望

吴浩亮，浦湧，孟祥平，崔胜宇，陶波，范稣圳，徐林*

（1.武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，湖北武汉430060；2.武汉大学人民医院汉南医院，湖北 武汉430000；3.武汉市第四医院，湖北武汉430000）

microRNA 是一类内源性双链非编码RNA，一般长度约为20～25 nt，在基因表达调控方面起着重要作用。自1993 年在秀丽隐杆线虫中发现了第一个 microRNA以来［1］，人们一直致力于关于microRNA 的功能研究。本文就microRNA 用于治疗心血管疾病的最新靶点，及其在临床治疗的应用和展望进行了总结。

1 microRNA 在心血管疾病中的作用

1.1 microRNA 与高血压

交感神经系统激活是高血压疾病进展中重要的病理生理因素［2］，抑制其激活可以降低动脉收缩压和舒张压，改善心肌纤维化和减少心肌细胞凋亡，能有效治疗高血压性心脏病和改善预后，延缓心力衰竭的进展［3］。交感神经系统的活动受肾上腺素能受体α1a（adrenergic receptor α1a，ADRA1A）的调节。ADRA1A 是一种G 蛋白偶联的跨膜受体，通过与内源性儿茶酚胺结合增加交感神经紧张性［4］。microRNA-19b（miR-19b）和microRNA-16（miR-16）可以靶向上调ADRA1A 基因的表达，分别向小鼠注射miR-19b 和miR-16 的拮抗剂或两者联合给药均能显著降低实验小鼠的动脉收缩压、舒张压，减少心肌细胞纤维化和凋亡，改善高血压进展和预后［5］。肾素-血管紧张素系统是引起高血压的另一重要病理生理机制，高水平的血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）通过中枢和外周调节机制导致血压增高，还可以使促炎细胞因子和活性氧的表达增加，诱导血管炎症和内皮功能障碍［6］。在一项动物试验中发现，microRNA-29b 可触发AngⅡ诱导的高血压和血管内皮损伤，其过程部分由CTRP6/ERK/PPARγ 轴介导，而下调miR-29b 可以减少AngⅡ的分泌，从而改善AngⅡ介导的高血压和血管内皮损伤［7］。

1.2 microRNA 与冠心病

1.2.1microRNA 与缺血再灌注损伤 心肌缺血再灌注损伤（I/R）是目前急性心肌梗死后再灌注治疗常见并发症［8］，严重影响患者预后。不同类型microRNA 对I/R 后损伤心肌起到了不同的保护作用，亦是治疗的新靶点。microRNA-15b（miR-15b）增加了缺氧条件下的心肌细胞耐受能力，动物试验研究发现，再灌注期间使用外源性microRNA-15b 治疗，梗死面积较对照组显著减小［9］。另一项研究发现，microRNA-327（miR-327）表达水平在心肌I/R后明显升高，利用腺病毒转染反义核苷酸沉默miR-327 可明显增加caspase-9、Cyt-c 和Bax 等抗凋亡分子表达水平，同时降低Bcl-2 等促凋亡分子的表达。因此抑制心梗后miR-327 过表达可以保护心肌细胞，减少再灌注后心肌梗死面积［10］。

在心肌I/R 损伤中，PIK3R3/AKT3 是具有保护作用的信号转导通路，microRNA-181b-5p（miR-181b-5p）通过直接与其3′-非翻译区结合而负性调控AKT3 和PIK3R3 的表达，而抑制miR-181b-5p 则可上调AKT3 和PI3KR3，起到保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤的作用［11］。

在大鼠急性I/R 模型中，循环microRNA-145（miR-145）的水平降低。通过腺病毒转染上调miR-145 表达水平，可显著降低缺血再灌注诱导的心肌电生理不稳定性以及心肌细胞凋亡和炎症反应，其机制是通过抑制CaMKII 介导的ASK1 抗凋亡途径和NF-κB p65 抗炎途径［12］。

1.2.2microRNA 与心肌梗死 随着冠脉介入手术的发展，急性心肌梗死的死亡率显著下降［13］，保护梗死后心肌，延缓和改善心梗后心力衰竭，增加患者远期生存率成为心肌梗死的治疗目标。有研究证实，microRNA-19a/19b 对成人心脏的保护分为两个阶段：心肌梗死后早期和长期保护。利用腺相关病毒转染microRNA-19a/19b 可以减轻心肌梗死引起的心脏损伤，保护心脏功能，并刺激心肌细胞再生［14］。microRNA-34a（miR-34a）是心肌梗死后心脏修复和再生的重要内源性调节因子，miR-34a 的过度表达直接加速了再生心肌细胞的死亡，而抑制miR-34a 可以促进心肌细胞周期活性和心肌细胞的修复，减轻心肌梗死后心肌重塑和纤维化［15］。

心肌梗死后患者常常发生恶性心律失常而死亡，因此增强梗死后心肌电生理稳定性是治疗的一大重点。Liu 等［16］的研究证实，通过上调microRNA-145 水平可以增强心肌细胞的电生理稳定性，改善心梗引起的心肌纤维化及心肌重塑，降低了心肌细胞对β 肾上腺素能受体（β-AR）刺激的反应，从而很大程度上减少了心肌梗死后恶性心律失常的发生。

1.3 microRNA 与心肌肥厚

心肌病理性肥厚与Ca2+持续内流有关。内流钙离子激活CaN-NFAT 通路诱导心肌肥厚［17］。诱导心肌肥厚的Ca2+主要通过L 型Ca2+通道（LTCCs）流入［18］。Chu 等［19］通过荧光素酶报告分析发现，microRNA-135b（miR-135b）靶向抑制L-型电压依赖钙离子通道α1C 亚基（CACNa1C）的表达。在主动脉缩窄小鼠模型中过表达miR-135b，可以减少Ca2+持续内流，明显减轻病理性心肌肥厚。Ang II 的慢性升高也是诱发心肌肥厚一个主要因素，但其作用的具体分子机制尚不清楚［20］。Yu 等［21］发现心脏和神经嵴表达的衍生物2（heart and neural crest derivatives-expressed 2，HAND2）参与Ang-II 诱导心肌细胞肥大过程，microRNA-92b-3p 可以减少HAND2 的表达，从而抑制Ang-II 诱导的心肌肥大。还有学者发现肥厚刺激心肌细胞microRNA-212（miR-212）和microRNA-132（miR-132）的表达上调，抑制miR-212 和miR-132 的表达对小鼠压力超载诱导的心肌肥厚有保护作用［22］，经进一步临床前研究发现，一种特定的miR-132 抑制剂可以逆转压力负荷超载诱导小鼠和猪的心肌肥厚［23］。

1.4 microRNA 与心律失常

microRNA 参与调节心脏兴奋的产生及传导等许多方面，包括除极、复极、自动除极、钙离子转运等过程［24］。房室结细胞是慢反应细胞，其细胞表面离子通道的状态会影响房室结信号的传导。microRNA-1（miR-1）的过表达降低了心肌细胞表面IK1和ICa，L离子通道密度，减慢了房室结的传导，增加小鼠对房室传导阻滞（AVB）的易感性。而使用miR-1 拮抗剂则逆转了这种变化，为临床治疗AVB提供了一种新思路［25］。房颤的发生同样也与L 型钙离子通道异常有关。L 型钙电流减弱会加速复极化，缩短心房动作电位持续时间（APD），增加房颤的发生率［26］。在治疗房颤的研究中，Lu 等［27］通过腺病毒转染在犬心房和小鼠体内过表达microRNA-328（miR-328），发现LCa，L电流减弱，心房APD 缩短，房颤易感性增强。而敲除miR-328 基因或注射miR-328 反义核苷酸沉默其表达，房颤易感性明显减弱。miR-328 这种促进房颤的作用是通过下调L型钙离子通道蛋白表达实现的，这使miR-328 有望成为未来房颤治疗的新靶点。

1.5 microRNA 与心力衰竭

心力衰竭是一种复杂的临床综合征，是大多数心血管疾病发展的终末状态。目前临床治疗心力衰竭的目标是改善患者生存质量，延缓心力衰竭的发展［28］。在心肌梗死诱发的心力衰竭中，早期间质纤维化是有利的，但长期过度的纤维化会造成心室壁僵硬，舒张和收缩功能障碍，最终发展为心力衰竭［29］。microRNA-1 能够逆转心力衰竭早期的心肌重塑已经在动物实验中得到证实［30］。在压力超负荷诱导的心力衰竭小鼠模型中，microRNA-221/222可以抑制TGF-β/SMAD 信号通路诱导的成纤维细胞增殖和分化［31］，从而可以抑制心力衰竭的发展。

线粒体氧化代谢为心肌细胞提供能量，其功能障碍是心力衰竭发生的重要病理机制［32］。LaRocca与其团队［33］研究发现microRNA-152（miR-152）可以直接靶向抑制维持线粒体铁稳态的关键蛋白谷胱甘肽5（Glrx5），使心肌细胞线粒体铁超载，能量供应受损，诱发心力衰竭。而利用反义核苷酸沉默miR-152 的表达可以延缓心衰的进展。

1.6 microRNA 与先天性心脏病

先天性心脏病是指心脏和血管在胚胎发育阶段出现结构异常，引起血流动力学异常的一种病变。心脏发育是一个极为复杂的过程，涉及到细胞分化和形态构建过程中基因表达的精确协调，越来越多的研究表明microRNA 在调控心脏发生和发育过程中发挥关键作用［34］。研究者通过构建先天性心脏病胎鼠模型，发现在先天性心脏病胎鼠的心内膜细胞中，microRNA-34a（miR-34a）表达上调，而抑制miR-34a 的表达则心内膜细胞生长抑制作用消失［33］。另一项类似的实验表明microRNA-592（miR-592）在小鼠的心脏发育中抑制心肌细胞增殖及 心脏发育，促进心脏畸形产生［34］。这 些microRNA 在心脏发育中发挥关键作用，其表达量的异常升高和降低都会影响心脏的发生和发育，从而导致先天性心脏病。调节这些关键microRNA 的表达将会是未来预防先天性心脏病的潜在措施。

1.7 microRNA 与其他心脏疾病

microRNA 还参与其他心脏疾病的病理过程的调控。大部分心脏瓣膜病是由于自身免疫机制失调，异常的免疫攻击导致瓣膜功能失调。其中，microRNA-155（miR-155）通过靶向miR-155-S1PR1和miR-155-SOCS1-STAT3 信号通路介导链球菌诱导的瓣膜损伤，而通过转染腺病毒抑制miR-155 的水平可以减轻心脏瓣膜损伤的进展［35］。研究发现，另一类老年退化性瓣膜病—动脉瓣钙化也与microRNA 异常调控相关，其中microRNA-34A（miR-34A）可以通过抑制Notch1 表达增加主动脉瓣钙沉积，进一步实验表明下调microRNA-34A 明显改善主动脉钙化的程度［36］。另外一些报道表明microRNA-214、microRNA-20、microRNA-29b 等也参与动脉瓣钙化机制的调节［37-38］。心肌病是心脏疾病的另一大重要分支，通常以遗传性因素引起心肌本身病变，表现为心室的肥厚或扩张。Zhou 等［39］通过对扩张性心肌病小鼠心脏组织microRNA 微阵列分析发现，与正常小鼠比较，扩张性心肌病的小鼠心脏组织中microRNA-208b（miR-208b）水平显著上调，随后的研究中通过增加和抑制miR-208b 的表达证明miR-208b 参与扩张性心肌病的病理过程。由于肥厚性心肌病病因较为复杂，多数模拟肥厚性心肌病的模型仍为压力超负荷模型，能反映在肥厚性心肌病机制中的microRNA 调控作用有限。其他与microRNA 调控相关的心脏疾病的研究多与生物标记物相关，治疗相关临床前研究鲜有，便不再赘述。

2 microRNA 在临床治疗中的应用

2.1 基于microRNA 治疗的临床设计

针对基因的治疗，可以基于DNA 及mRNA。两者相比较，基于mRNA 疗法有诸多优势，例如作用范围广、安全性高、成本低且更为高效［40］，其中利用microRNA 调节mRNA 的基因治疗方案逐渐趋于成熟。临床上开发一种microRNA 药物都会经历以下步骤：首先研究感兴趣的疾病模型与正常机体组织之间microRNA 的表达差异，其次对所筛选的microRNA 进行功能及机制研究。再次，结合患者体内microRNA 水平设计相应的治疗方案。如果需要对microRNA 进行功能增益，可以通过引入合成microRNA 来完成；相反，如果需要相应的microRNA功能丧失，可以利用反义寡核苷酸沉默其表达。对microRNA 治疗方案的靶向性、安全性、药效动力学、药代动力学进行研究后，对microRNA 分子进行优化，增加治疗作用，降低毒性后即进入动物实验研究和临床试验［41］。

2.2 microRNA 在心脏疾病中的临床应用

在其他疾病治疗领域，基于microRNA 的疗法已应用于临床，例如microRNA-122 的反义抑制剂治疗丙型肝炎［33］，microRNA-34 治疗肝细胞癌［42，43］，microRNA-506 治疗鼻咽癌［44］等。目前，microRNA在心脏疾病中的应用大部分聚焦于作为疾病发生及进展中的生物标记物。随着研究的深入，首例microRNA-132（miR-132）抑制剂治疗心力衰竭已经进入临床试验阶段。在这项随机对照双盲临床试验中［45］，与安慰剂组对比，新型的miR-132 抑制剂CDR132L 显著减少了患者体内miR-132 水平，患者心功能明显改善，射血分数升高，NT-proBNP 水平下降，并且没有明显的毒副作用。这项临床试验的成功标志着microRNA 治疗心脏疾病正式进入临床，为未来其他microRNA 进入临床治疗心脏疾病开辟了先例。但值得关注的是，此例临床试验应用的是microRNA 抑制剂。由于microRNA 自身不稳定、易降解，针对microRNA 替代治疗方案，例如运输microRNA 的载体，仍然存在一定问题。

2.3 载体技术的发展

早期，一些未经修饰或者简单修饰的microRNA，在没有结合载体的条件下应用于临床，剂量过大和临床疗效有限使人们对于microRNA 的治疗效果产生质疑［46］。随着研究的深入，人们发现microRNA 分子本身是亲水性的，而细胞膜对亲水性物质通透性很低，裸microRNA 很难被细胞摄取［47］，肝肾的代谢作用也会快速消除体内外源性microRNA［48］。因此科学家开始对运载microRNA 的载体进行探索。目前常用的载体（图1 所示）介绍如下。

图1 常见的几种microRNA 载体

2.3.1病毒载体 腺相关病毒（AAV）在肝脏、肌肉和神经等组织中转导效率优越，使它成为基因治疗较为理想的载体［49］，已批准进入临床，越来越多的临床试验证明了其疗效［50］。但有研究发现，应用AAV 作为microRNA 治疗载体不可避免地存在细胞毒性［49］。在一项动物实验中，研究者通过腺相关病毒载体传递来源于人的miR-132-199a 以刺激猪心肌梗死后心脏的修复。一个月后实验组心脏功能改善明显，瘢痕大小也显著缩小，但随后持续出现无法控制的microRNA 表达使实验猪突发心律失常而死亡，这使科学家们认识到腺相关病毒介导的microRNA 基因转录存在过表达危害［51］。同样，向正常新生小鼠和患有粘多糖贮积症新生小鼠注射表达β-葡萄糖苷酶的AAV 载体会增加小鼠罹患肝细胞癌的风险，证明AAV 作为基因载体具有明显的基因毒性［52］。虽然小鼠与人类基因不具有同源性，但是可以为AAV 作为基因载体治疗人类疾病提供一定的风险预警，并促使研究者们开始逐渐将目光聚焦于非病毒基因载体。

2.3.2外泌体载体 相较于病毒载体，外泌体运载microRNA 具有显著优势。它是细胞间天然的RNA运载系统，可以保护运载的microRNA 免受循环内RNA 酶的消化，且易于被细胞所摄取［53］。但外泌体作为microRNA 运载体在实际操作过程中也存在一些技术难题，如靶向性不高，不能与特定的靶向病变组织或细胞结合，从而导致治疗效果不佳和脱靶效应［54］。而利用超声辅助将很大程度上增强靶向性，减少靶外效应［55］。其次，外泌体存在产量低，难以大量获取的问题，限制了其在临床上的应用。因此，研究人员开发了红细胞外泌体用于运载microRNA，可以相对克服这种劣势［56］。关于外泌体递送系统的研究仍在不断优化中。

2.3.3无机纳米材料载体 一大批纳米无机高分子材料开始被尝试作为运载体转运microRNA，例如纳米水凝胶载体［57］、生物活性玻璃纳米颗粒载体［58］、磷酸钙纳米载体［59］和氧化石墨烯载体［60］等。然而，研究发现大多数无机纳米材料具有细胞毒性，显著降低了细胞活性。microRNA 与非病毒载体相互作用比较强，难以释放［61］。多数无机材料难以在体内降解，会产生蓄积效应，对机体产生毒性，因此纳米无机高分子材料作为microRNA 运载体也存在着诸多的技术难题，目前临床上尚无切实可行的靶向核酸运载载体用于治疗心血管疾病［62］。

综上所述，microRNA 参与多种心脏病理生理状态的调节，在未来心血管疾病治疗中应用前景广阔。最新的microRNA 抑制剂治疗心力衰竭在临床上取得成功标志着microRNA 治疗心血管疾病大时代的到来。但microRNA 自身应用于临床治疗仍存在诸多挑战，例如microRNA 的稳定性、安全性、载体靶向性和生物相容性等。但我们相信通过对microRNA 作用机制的不断探索以及对载体的持续改进，microRNA 终将会成为未来临床治疗心血管疾病的一把利剑，为心血管疾病患者带来福音。