新疆地区育龄妇女叶酸代谢酶基因多态性分布的研究

钱 芳，纵瑞奇，王 军，王志勇

(1.新疆维吾尔自治区第八人民医院遗传科，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆维吾尔自治区科技项目服务中心项目中心，新疆 乌鲁木齐 830000；3.新疆维吾尔自治区第八人民医院检验科，新疆 乌鲁木齐 830000；4.新疆维吾尔自治区第八人民医院男科，新疆 乌鲁木齐 830000)

随着社会经济的快速发展和医疗服务水平的显著提高，我国婴儿死亡率和5岁以下儿童死亡率持续下降，危害儿童健康的传染性疾病得到控制，但是新生儿出生缺陷问题日益凸显。我国出生缺陷发生率约为5.6%，每年新增出生缺陷约90万例，出生缺陷已成为影响儿童健康和出生人口素质的重大公共卫生问题[1]。母体叶酸缺乏是引起出生缺陷的重要原因。叶酸缺乏能引起神经管畸形、先天性心脏病等先天缺陷发生，对儿童神经认知发育等亦可造成明显影响[2-3]。而叶酸补充过量亦会对孕妇及胎儿造成严重的后果[4]。此外，亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase，MTRR)可通过影响叶酸的代谢和利用能力，从而影响出生缺陷的发生风险[5]。因此，个体化叶酸补充对改善母婴结局具有重要的意义。本研究拟探讨新疆地区汉、维、哈族育龄妇女叶酸代谢酶基因多态性分布，为新疆地区制定叶酸个性化增补方案以及出生缺陷的一级防控，提供参考依据。

1资料与方法

1.1研究对象

于2019年1月至2020年12月，随机选取新疆维吾尔自治区14个县市(库车县、墨玉县、喀什市、尉犁县、尼勒克县、巩留县、富蕴县、布尔津县、呼图壁县、木垒县、吉木萨尔县、乌苏市、乌鲁木齐米东区和哈密市)的汉族、维吾尔族和哈萨克族的4 555例育龄妇女作为研究对象，收集其一般资料[年龄、孕次和身体质量指数(body mass index，BMI)]。纳入标准：①育龄期女性；②民族为汉族、维吾尔族或哈萨克族；③完成叶酸代谢酶基因多态性测定且可耐受；④知情同意参与本研究。排除标准：①精神或认知功能异常者；②存在高血压、心脏病或肾病等慢性疾病者；③存在血液系统疾病、严重肝肾功能异常或自身免疫系统疾病者。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂

Taqman-MGB探针；低温离心机(型号：J-6BABI，购自Beckman)、7900型荧光定量PCR仪，试剂为Buffer A、Buffer B、饱和酚、氯化钠及异丙醇等，均购自美国Applied Biosystems(AB)公司。

1.2.2检测方法

使用乙二胺四乙酸抗凝管采集育龄妇女静脉血样3mL，离心30min，速度4 000rpm，分离后放置在低温下，备用。采用荧光定量PCR技术检测叶酸代谢酶基因多态性(MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G)。PCR反应体系总体积为10uL(包括基因组DNA 1uL、Taqman Universal Master Mix 5uL、Taqman-MGB探针0.5uL、去离子水3.5uL)。借助Primer 5.0软件完成C677T位点特异性引物的检测，具体方法如下：Primer F：5′-TGGTGGGCCGCAGAACATGTGC-3′(25bp)；R：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′(32bp)；设定反应条件：30℃ 10min；42℃ 30 min；99℃ 5 min；5℃ 5 min，合计完成35个循环，72℃延伸10min。将最终获得的产物置于浓度为1.5%琼脂凝胶电泳(引物由美国Invitrogen生物技术有限公司提供)。上述操作完毕后，在ABI 7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，并借助分析软件确定不同标本中基因分型情况。

1.3统计学方法

2结果

2.1一般资料比较

本研究共纳入4 555例育龄妇女，其中汉族2 162(47.46%)人，维吾尔族1 376(30.21%)人，哈萨克族1 017(22.33%)人。汉族、维吾尔族和哈萨克族育龄妇女的年龄和孕次差异均具有统计学意义(F值分别为21.37和18.30，P<0.05)，但BMI差异不具有统计学意义(F=0.18，P>0.05)，见表1。

表1 汉、维、哈族育龄妇女一般资料比较Table 1 Comparison of general data among the Han，Uygur and Kazakh ethnic women of childbearing

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果

汉族、维吾尔族和哈萨克族育龄妇女的MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G基因多态性分布均符合遗传平衡定律(P>0.05)，表明样本具有区域群体代表性。

2.3基因型频率比较

汉族、维吾尔族和哈萨克族育龄妇女MTHFRC677T主要基因型分别为CT、CT和CC，MTHFRA1298C主要基因型均为AA，MTRRA66G主要基因型分别为AA、AG和AG，三者MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G基因型分布差异均具有统计学意义(χ2分别为537.28、192.18、381.02，P<0.05)，见表2。

表2 汉、维、哈族育龄妇女叶酸代谢酶基因的基因型频率比较[n(%)]Table 2 Comparison of genotype frequencies of the genes of folate metabolizing enzymes among the Han，Uygur and Kazakh ethnic women of childbearing age[n(%)]

2.4等位基因频率比较

汉族、维吾尔族和哈萨克族育龄妇女MTHFRC677T主要等位基因分别为T、C和C，MTHFRA1298C主要等位基因均为A，MTRRA66G主要等位基因均为A，三者MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G等位基因分布差异均具有统计学意义(χ2分别为572.72、194.48、387.33，P<0.05)，见表3。

表3 汉、维、哈族育龄妇女叶酸代谢酶基因的等位基因频率比较[n(%)]Table 3 Comparison of allele frequencies of the genes of folate metabolizing enzymes among the Han，Uygur and Kazakh ethnic women of childbearing age[n(%)]

3讨论

3.1叶酸代谢酶基因多态性的影响

出生缺陷受环境、营养与遗传因素的共同影响，叶酸在维持胚胎正常发育过程中发挥重要的作用，孕妇叶酸缺乏能引起多种出生缺陷。叶酸介导的单碳代谢途径是染色质甲基化、磷脂生物合成、细胞增殖以及众多代谢物的合成和分解代谢的关键[6]。MTHFR是叶酸代谢的关键酶，可将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate，5-MTHF)，使之能为同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)提供甲基形成甲硫氨酸。MTHFRC677T突变导致丙氨酸被缬氨酸取代，编码的蛋白质具有较低的酶活性，杂合子和纯合子酶活性分别降低30%和60%，导致Hcy浓度升高[7]。较高水平的母体血清Hcy可以通过上调组蛋白H3K79Hcy来调节神经管畸形相关基因的表达[8]。MTHFRA1298C突变导致谷氨酸被丙氨酸取代，使MTHFR活性降低，但不如MTHFRC677T突变明显[9]。MTRR对叶酸循环中DNA和组蛋白的甲基化至关重要，其能协同维生素B12维持甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，MTR)的活性，使MTR以5-MTHF为底物，催化Hcy合成甲硫氨酸。MTRRA66G突变导致甲硫氨酸被异亮氨酸取代，降低了MTR的活性，影响相关基因和通路的表观遗传调控，从而造成胎儿先天缺陷[10]。

3.2叶酸代谢酶基因多态性的人群分布差异

本研究显示，新疆地区汉、维、哈族育龄妇女叶酸代谢酶基因多态性分布存在明显的差异性。许敏等[11]的研究发现，汉族育龄妇女MTHFRC677T等位基因突变频率高于维吾尔族和哈萨克族育龄妇女，但MTHFRA1298C和MTRRA66G等位基因突变频率低于维吾尔族和哈萨克族育龄妇女，与本研究结果一致。既往研究[9,12]显示，MTHFRC677T和MTRRA66G突变频率与纬度呈正相关，与我国出生缺陷发生率北高南低的分布一致，但MTHFRA1298C突变频率与纬度呈负相关。本研究中汉族育龄妇女MTHFRC677T等位基因突变频率高于陕西、湖北、广东等地[13]。因此，叶酸代谢酶基因多态性分布存在遗传异质性，加之地理环境、生活方式和饮食习惯的不同，导致出生缺陷在育龄妇女中的易感性不同。新疆维吾尔自治区幅员辽阔，多民族聚居，加强新疆地区育龄妇女叶酸代谢酶基因多态性的测定，能明确新疆地区育龄女性中相关基因型和等位基因频率等遗传数据，以便基于群体特征开展针对性的妇幼保健服务。

3.3叶酸个性化增补方案的意义

从2009年开始，我国开始实施农村育龄妇女免费增补叶酸预防神经管畸形的公共卫生政策，在降低神经管畸形的发生中发挥了重要作用。然而，仍有部分孕妇增补叶酸后，胎儿发生神经管畸形，主要是由于叶酸利用能力低下或叶酸补充过量引起。包燕等[14]基于叶酸利用能力风险等级对孕妇给予不同剂量的叶酸干预，发现干预后的孕妇血清Hcy水平和出生缺陷情况差异不具有统计学意义，表明叶酸个性化增补方案可以降低叶酸过量引起的负面健康效应，提高临床效能。Yang等[15]发现叶酸个体化补充剂量组的先天性心脏病、早产、巨大儿等发生率低于叶酸统一补充剂量组，妊娠结局显著改善。此外，孕期叶酸水平还可影响子代神经发育轨迹，较低的产前叶酸水平与胎儿脑细胞数量减少和脑重量减轻有关[16]。因此，叶酸个性化增补方案对预防出生缺陷、提高出生人口素质具有重要意义。

综上所述，新疆地区汉、维、哈族育龄妇女叶酸代谢酶基因多态性分布存在明显的差异性，应加强叶酸代谢酶基因多态性测定，指导叶酸个性化增补方案，以降低新生儿出生缺陷发生率。