蜱媒Dabieshan病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立*

何 婷 艾乐乐 朱长强 胡 丹 王长军 李 萌 谭伟龙**

(1.南京医科大学附属儿童医院输血科，江苏南京 210000； 2.东部战区疾病预防控制中心，江苏南京 210000)

蜱虫是一类专性吸血的媒介节肢动物，可以传播细菌、病毒、立克次体等多种病原体(Chenetal., 2014)。其中，克里—米亚刚果出血热病毒(CCHFV)(Leblebiciogluetal., 2016)、蜱传脑炎病毒(TBEV)(Lindquistetal., 2008)和发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)(Yuetal., 2011)等对人类具有较高的致病性。Dabieshan病毒和SFTSV、哈特兰德病毒(HRTV)(Mcmullanetal., 2012)同属布尼亚病毒目、白纤病毒科、白蛉病毒属，节段式单股负链RNA病毒。2015年通过高通量测序技术首次发现该病毒(Shietal., 2016)。2016年本课题组通过对舟山地区蜱虫高通量测序及特异性PCR技术发现该地区蜱虫中广泛携带Dabieshan病毒，阳性率高达64.9%(Zhuetal., 2020)。大多数布尼亚病毒NP蛋白能够与RNA结合，协助RNA转录和复制，在病毒的入侵和定植中发挥作用(Fieldsetal., 1993)。本课题组前期发现的Dabieshan病毒NP蛋白(GenBank序列号MN723842.1)，虽然与致病的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) (GenBank序列号YP006504092.1)以及裂谷热病毒(Rift Valley fever virus)(GenBank序列号ABQ2358.1)同属于白蛉病毒属的分支，但其位置上相距较远，同源性只有29.88%和35.00%。相反，与2015年发现的Dabieshan病毒(GenBank序列号KM817733.1)和Yongjia病毒(GenBank序列号AJG39335.1)同源性比较高，分别为100%和55.06%(何婷，2019)。为了明确Dabieshan病毒NP蛋白的生物学功能，解析该病毒的潜在致病性和流行病学特征，实现对舟山地区虫媒病毒的监控和预警，本文以Dabieshan病毒NP蛋白生物信息学分析为基础，成功表达和构建一种以NP蛋白为包被抗原的高特异性和敏感度的间接ELISA方法，后续将对采集地人群动物进行血清学的初步筛查。

1 材料与方法

1.1 材料

限制性内切酶XhoI/EcoRV、T4连接酶、JM-109/BL-21感受态细胞和质粒提取试剂盒均购自宝生物工程有限公司(大连)；Goat-anti-rabbit/mouse IgG-HRP购自博奥森生物技术公司(北京)；Anti-6×His Tag mouse monoclonal antibody购自Thermo Fisher Scientific(美国)；pET-32a空载体质粒由实验室提供；Dabieshan病毒阳性cDNA来自舟山地区长角血蜱Haemaphysalislongicornis样本，由本实验室-80 ℃低温冰箱保存；抗SFTSV病毒NP蛋白阳性兔血清由课题组提供(诸葛尧尧，2020)。

1.2 NP蛋白基因序列扩增

以Dabieshan病毒阳性的cDNA为模板，以带有ECORV酶切位点的上游引物C C GG A T A T CA T G G G C G A C C A A G A T C TG和带有XhoI酶切位点的下游引物C C GC T C G A GT C A G C C C A G G A G C T G G C GG进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)： 2×premix taq 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 25 μL。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min共计35循环，最后延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定以后，回收纯化目的片段。

1.3 重组质粒构建

将纯化好的带有酶切位点的NP基因片段和pET-32a空载体质粒进行双酶切反应，酶切产物经1%琼脂糖凝胶鉴定后回收纯化。T4连接酶于16 ℃连接NP片段和载体片段，重组质粒经JM109感受态细胞转化，扩增培养后，收集纯化pET-32a-NP质粒，并且用T7通用引物进行测序，保证序列连接的准确性。

1.4 重组蛋白表达纯化

将pET-32a-NP质粒转化到BL21感受态细胞中，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导蛋白高表达，37 ℃培养4 h后，冰浴超声破碎菌体后，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE确定蛋白表达形式，用含His-tag的镍柱对蛋白进行收集纯化。

1.5 Western Blot实验

将经镍柱收集纯化的NP重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜，用5%脱脂乳4 ℃封闭过夜。以抗-His单克隆抗体(1∶5000)为一抗，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗3次,再加入HRP标记的羊抗鼠IgG (1∶5000)为二抗37 ℃孵育1 h，TBST缓冲液洗3次后显色。

1.6 间接ELISA方法建立

1.6.1包被NP抗原浓度确定:将经Western Blot鉴定后的NP蛋白(原始浓度为300 μg/mL)按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048 倍比稀释包被ELISA板，将兔血清按照1∶104、 1∶ 5×104和1∶105比例稀释后作为一抗，棋盘滴定法依据P/N值确定抗原抗体最佳反应比。

1.6.2酶标二抗浓度确定：以棋盘滴定结果确定的最佳抗原包被浓度和一抗浓度作为反应条件，在此条件下，将二抗以1∶1000，1∶5000和1∶10000比例稀释，确定二抗最佳反应浓度。

1.6.3最佳底物反应时间确定：根据上述实验确定的最佳抗原抗体反应浓度，设置3个孔，分别显色5、10和15 min，确定最佳底物显色时间。

1.7 特异性实验

按照上述确定的最佳试验条件，以发热伴血小板减少综合征NP蛋白兔免疫血清作为对照，确定Dabieshan病毒NP蛋白是否和发热伴血小板减少综合征病毒阳性血清存在血清学交叉反应。

1.8 板内重复性实验

按照上述确定的最佳实验条件，设置3块ELISA板，每块板随机选取8个孔，重复滴定，测定各孔OD450值。

2 结果

2.1 重组质粒阳性克隆PCR验证

利用针对PET-32a质粒载体的通用引物对T7，对转化有PET-32a-NP重组质粒的感受态细胞JM109的单克隆菌落进行PCR验证，如图1所示。将PCR阳性的单克隆扩增培养后进行DNA测序，返回序列在NCBI核苷酸数据库上进行比对，没有gap，也没有突变位点形成终止密码子，说明序列插入正确，pET-32a-NP质粒构建成功，可用于后续的蛋白原核表达。

图1 PCR验证单克隆菌落Fig.1 Identification of monoclonal colony by PCR1,4,5,7：阳性菌落；2,3,6：阴性菌落.1,4,5,7: Positive colony; 2,3,6: Negative colony.

2.2 重组蛋白表达形式鉴定

经重组质粒小样诱导表达后发现，IPTG能够诱导NP蛋白顺利表达。由于蛋白是可溶性表达还是以包涵体形式存在，将影响后续蛋白的纯化方法，所以将全菌、上清和沉淀分别进行SDS-PAGE。结果如图2-a所示，发现在上清和沉淀中均有表达，条带大小48 kDa与预期一致，因上清表达量强于沉淀并且上清中可溶性蛋白纯化操作较为简便，故选取上清作为后续NP蛋白纯化的对象。如图2-b所示，用不同浓度咪唑进行洗脱收集，各浓度洗脱液经SDS-PAGE电泳发现，咪唑浓度在100～200 mmol/L时，目的条带纯度最高。

图2 NP蛋白表达纯化Fig.2 The expression and purification of NP proteina:重组蛋白表达形式鉴定; b:不同浓度咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳鉴定.a: Identification of the expression forms; b: SDS-PAGE electrophoresis analysis.

2.3 Western Blot实验

由于纯化的NP重组蛋白上表达6 × His-tag，可以与抗-His单克隆抗体有特异性结合反应。Western Blot实验结果如图3所示，显示在48 kDa处出现特异性单一条带，与SDS-PAGE条带大小相符合。

图3 Western Blot鉴定重组蛋白Fig.3 Western Blot of expressed recombinant protein

2.4 间接ELISA反应条件的确定

2.4.1抗原抗体反应浓度的确定: 棋盘滴定结果表明，当NP蛋白按1∶128稀释(原始浓度为300 μg/mL)，兔血清按1∶5×104稀释时，P/N反应值最大，表明该稀释度下，抗原抗体结合反应最佳。

2.4.2二抗反应浓度的确定: 按照上述优化的最佳抗原抗体稀释比例，将商品化羊抗兔IgG-HRP抗体作为二抗按照1∶1000，1∶5000和1∶10000 稀释，检测不同二抗稀释度下P/N值。结果表明，当以1∶5000稀释度稀释二抗时，P/N反应值最大。

2.4.3最佳底物反应时间: 按照上述优化的反应条件，设置检测底物反应时间为5、10和15 min时的P/N值，发现当显色时间为15 min时，P/N反应值最大。

2.5 血清学反应特异性

利用以上建立的间接ELISA方法，对抗SFTSV病毒NP蛋白阳性兔血清进行检测。结果如图4所示，发热伴血小板减少综合征病毒抗NP兔血清与Dabieshan病毒重组NP蛋白不存在交叉反应，特异性好。

图4 间接ELISA方法特异性检测Fig.4 Identification of the specificity of the indirect ELISA method

2.6 板内重复性检测

测定每块板8个复孔OD450，计算ELISA板板内变异系数，结果如图5显示，板内变异系数范围在5.57%～8.22%，表明该ELISA板内重复性较好。

图5 重复性实验Fig.5 The repeat tests of the indirect ELISA method

3 讨论

蜱虫作为一种专性吸血的节肢动物，可携带并传播有大量病原体，近年来，不断出现由于蜱虫叮咬而染病的报道(Yuetal., 2011; Mengetal., 2019)。高通量测序技术的应用极大地丰富了人们对蜱媒病毒的了解，2015年通过高通量测序技术首次发现新病毒—Dabieshan病毒的存在(Lietal., 2015)。与传统的白蛉病毒属不同，Dabieshan病毒存在M片段缺失的现象。本课题前期研究发现，浙江舟山群岛地区蜱虫自然感染Dabieshan病毒率较高，而江苏盐城地区则未检出该病毒。作为一种新发现的病毒，对于Dabieshan病毒本身繁殖周期和对人类感染性和致病性的研究资料甚少。因此，了解人群中Dabieshan病毒的流行情况，对于判断该病毒的致病性有重要参考价值。

间接ELISA作为一种利用固化已知抗原检测未知血清样本的方法，适用于大规模临床血清样本的筛查，特别是现场快速筛查和基层医疗初筛( Newcombeetal.,2007)。本研究中通过摸索最佳抗原抗体反应浓度、二抗反应浓度和底物反应时间等一系列实验条件对Dabieshan病毒间接ELISA检测方法进行优化，初步确认了该方法具有较好的重复性和特异性。IgG类抗体在体内存在时间长、含量高、易于检测，可检测既往感染情况。本实验探究性地将新建立的ELISA方法应用于蜱虫高携带Dabieshan病毒的区域(舟山)和未携带区(盐城)人群的血清学检测，本次测定的人群OD450值均较低，大都集中正在0.2附近，且两地区人群血清中抗NP抗体含量不存在显著性差异，表明舟山地区可能不存在Dabieshan病毒引起的既往感染(由于缺乏人群的阴性和阳性对照，故实验结果未列出相关数据)。但由于本次测定所选取的人群标本来自健康人群，因此加入真正的阳性及阴性对照并进一步扩大人群的检测范围，将更具有科学意义和应用价值。携带Dabieshan病毒的蜱虫一部分来自于牛、羊等家畜，至于这些动物血清中是否存在相应病毒NP抗体也是后续研究需要明确的内容。本次研究成功制备了Dabieshan病毒NP蛋白抗原，为Dabieshan病毒蛋白功能研究和疫苗研制奠定基础；以NP蛋白为固相抗原成功构建的间接ELISA方法，可望应用于人群血清学筛查，为了解该病毒致病性和传染性乃至科学防控措施提供了重要的人群流行资料。