中药提取物对IBDV感染SPF鸡的防治效果

朱买勋，唐红梅，闫志强，陈春林，翟少钦

(重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

病毒的高度变异和抗病毒药物的缺乏，增加了畜禽病毒性疫病的防控难度，寻求具有选择性杀灭病毒而不损伤畜禽机体细胞的药物是有效防控畜禽疫病的主要手段。中药是中国流传数千年的瑰宝，基于长期的临床经验来筛选和研究有效抗病毒的药物，实现“老药”新用是现代挖掘抗病毒方法的有效途径，有助于抗病毒类新兽药的研发。鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种免疫抑制病，该病在全球范围内广泛传播，并且可以通过垂直传播和水平传播的方式进行扩散[1-2]。IBDV属于双RNA病毒科禽双 RNA 病毒属，基因组包括两条双链RNA，编码的氨基酸区段存在高变区(Hypervariable region，HVR)，已经从原来的经典毒株渐渐变异成IBDV超强毒株(Very virulent IBDV,vvIBDV)，仅2018年，中国黑龙江、辽宁、河北、山东、江苏、浙江、云南7个省检测到 IBDV 新型变异株的流行，并在不断蔓延[3]。美国纽约也分离出包含vvIBDV的新型毒株，且感染4周龄SPF鸡，能在4 d内达到100%发病和68.7%死亡[4-5]，发病鸡法氏囊坏死并免疫抑制，免疫系统被严重损害，严重危害养鸡业的发展[6-7]。2020年，OIE将vvIBDV造成的疫病列为117种烈性传染病之一[8]。

对IBD的防控，现在主要以接种疫苗进行预防为主，但由于病毒表面蛋白存在连续突变风险，导致免疫失败，产生免疫盲区。药物预防也是防治IBD的主要手段，尤其是中兽药，富含大量的营养成分和天然活性物质，在增强动物免疫力和抗病毒方面均有其独特效果。能干扰IBDV的复制和阻滞其穿入宿主细胞[9]，提高外周血和脾淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+T细胞百分率，改变CD4+/CD8+比值，促进对机体免疫系统的调控[10]，提高抗体效价，有效保护雏鸡法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官，减轻病毒对其的损伤程度[11]，进而实现防治IBDV的效果。本研究在中药复方提取物可以增强免疫抑制雏鸡的免疫功能和提高IBD疫苗免疫效果的基础上[12-13]，采用IBDV人工感染SPF鸡，旨在进一步明确中药复方提取物防治IBDV的效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中药提取物(Traditional Chinese medicine extract，简称TCME)，按2∶2∶1∶1的质量比称取女贞子(LigustriLucidiFructus)、黄芪(AstragaliRadix)、枸杞子(LyciiFructus)、菟丝子(CuscutaeSemen)，经过水提取、过滤，制备成浸膏，添加可溶性淀粉制成规格为每1.0 g提取物中含1.0 g的原生药。

鸡传染性法氏囊病毒(CVCC编号：AV7)购于中国兽医微生物菌种保存中心，由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所扩增保存。

SPF鸡胚和SPF雏鸡均购于济南斯派瑞福禽业科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒EID50的测定 利用鸡胚测定病毒滴度， 10倍稀释法用PBS将IBDV种毒稀释10个梯度，每个梯度病毒稀释液分别接种9～11日龄SPF鸡胚的尿囊腔，每个梯度接种7胚，接种量为每胚100 μL，另选7胚接种等量的PBS作为阴性对照，37 ℃培养，接种后每天照蛋观察鸡胚发育情况，记录死胚数量，并采集鸡胚尿囊液进行ELISA检测(购于武汉Abebio公司)，接种后第7天，存活的胚胎处死后，检测判定鸡胚是否为阳性。参照Reed-Muench法[14]计算病毒EID50。EID50=10-[A+(B-50)/(B-C)]

式中：A为高于50%的病毒稀释度；B为高于50%的百分数，C为低于50%的百分数。

1.2.2 动物分组及管理 分组及饲养管理：150羽3周龄的SPF雏鸡，预饲1周后，随机分为5个组，分别为对照组、模型组和中药提取物高、中、低剂量组，每组3个重复，每个重复10羽雏鸡。各组雏鸡采用单笼立式隔离饲养，自由饮水，饲喂相同的饲料。

给药：中药提取物高、中、低剂量组分别在饮水中添加10.0、5.0、2.5 g/L的中药提取物，连续添加7 d，对照组和模型组不添加任何药物。

攻毒：给药完成后，试验组雏鸡分别通过滴鼻接种含100 EID50/100 μL的IBDV，对照组滴鼻等量的生理盐水。攻毒后，连续2周观察雏鸡的生存状态。

1.2.3 雏鸡的生存分析 在整个试验期间，观察雏鸡的临床变化，称量体质量，统计雏鸡每天的死亡情况，计算每组雏鸡的成活率(S)。

S=(N-D)/N×100%

N为试验动物数；D为死亡动物数。

1.2.4 样品的采集与处理 攻毒后2周，空腹 8 h称量雏鸡体质量，之后脱臼处死雏鸡，无菌解剖，采集完整的胸腺、脾脏和法氏囊，称量质量，计算免疫器官指数，称量之后剪碎，迅速放入液氮中保存，同时多点采集心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌肉(胸部和腿部)等组织，剪碎后迅速放入液氮保存，用于提取组织中病毒RNA。

I=Iw/Aw

I为免疫器官指数；Iw为免疫器官质量(mg)；Aw为试验动物体质量(g)。

1.2.5 脏器中病毒载量检测 根据GenBank中IBDV毒株全基因序列，设计扩增IBDVVP2基因的引物，上游引物：5′-TCCTTCTACAACGCTATCA-3′，下游引物：5′-TACCTCGTACCCCTTGTC-3′，内参基因β-actin上游引物：5′-GCCAACAGAGAGAAGATGACAC-3′，下游引物：5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各组雏鸡的肝脏、肺脏、胸腺、脾脏、法氏囊、肾脏、肌肉(胸部和腿部)等组织采用液氮冷冻研磨，提取RNA，通过核酸蛋白定量检测仪测定提取的病毒RNA的质量浓度和纯度，反转录为cDNA。对VP2和内参基因进行PCR扩增，VP2基因扩增产物分别稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等不同质量浓度的模板，添加SYBR Primix ExTaqMix(2×) 10 μL，上下游引物各0.5 μL，不同质量浓度PCR产物模板1 μL，加ddH2O补足20 μL。反应条件为： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， 30个循环；75 ℃延伸10 min，每个循环后进行读板，反应结束后系统自动生成熔解曲线及标准曲线。建立标准曲线后，样品均采用10 μL体系进行荧光定量检测。

1.2.6 数据统计分析 试验数据采用SPSS 20.0中GLM模块进行方差分析；组间差异有统计学意义时，采用Duncan’s法进行多重比较。荧光定量PCR试验中，为降低RNA定量、反转录及PCR反应效率的差异对结果的影响，VP2基因表达强度分别以绝对拷贝数/β-actin绝对拷贝数表示。将模型组的表达量设置为100倍，计算其他组雏鸡各免疫器官中相应基因相对于模型组的表达变化。数据以“平均值+标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 病毒EID50测定结果

由表1可知，按照Reed-Muench法计算得出IBDV病毒液EID50为1×10-6.91/100 μL。

表1 病毒EID50的测定结果Table 1 The measurement results of viral EID50

2.2 雏鸡成活率

由表2可知，对照组雏鸡未出现死亡，成活率为100%。攻毒后第3天，除中剂量组外，其他组雏鸡开始出现死亡，攻毒后第4天～第7天为死亡高峰期，之后维持相对稳定状态。试验结束后，模型组雏鸡成活率低至30.00%，高剂量组为 86.67%，中剂量组为93.33%，低剂量组为 70.00%，说明中药提取物能提高雏鸡的成活率。

表2 成活雏鸡统计结果(n=30)Table 2 Statistical results of survival chicks(n=30)

2.3 免疫器官指数变化

由表3可知，雏鸡在接种IBDV后，模型组雏鸡的脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数显著高于对照组(P<0.05)，而使用中药提取物进行预防的雏鸡脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数明显降低，高剂量组雏鸡脾脏指数显著低于模型组和低剂量组(P<0.05)，法氏囊指数显著低于模型组(P<0.05)。中剂量组胸腺指数显著低于模型组和低剂量组(P<0.05)，法氏囊指数显著低于模型组(P<0.05)。

表3 雏鸡免疫器官指数Table 3 The results of chicks’ immune organ index

2.4 病毒在组织中分布结果

由表4可知，雏鸡在接种IBDV后，IBDV能在肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊、胸腺的组织中分布，对使用中药提取物预防后的雏鸡进行组织中病毒核酸检测，结果显示高剂量组雏鸡的肾脏、肺脏、肌肉组织中病毒核酸均为阴性，脾脏组织部分为阴性，肝脏、法氏囊、胸腺组织均为阳性。中剂量组和高剂量组雏鸡的肾脏、肺脏、肌肉组织均为阴性，脾脏和法氏囊组织部分为阴性，肝脏和胸腺组织为阳性。低剂量组只有肺脏和肌肉组织为阴性，肾脏组织部分为阴性，法氏囊、脾脏、肝脏、胸腺组织均为阳性。

表4 雏鸡组织中病毒核酸检测结果Table 4 Detection results of viral nucleic acid in chick tissues

2.5 免疫器官中IBDV的载量分析

由图1～3可知，对照组雏鸡的脾脏、胸腺和法氏囊中均未检测到IBDV，表明雏鸡未感染病毒。以模型组为基准，高剂量、中剂量和低剂量组的雏鸡脾脏组织中IBDV载量分别降至模型组的(0.26±0.08)、(0.20±0.06)、(0.86±0.16)倍，高剂量组和中剂量组极显著低于模型组和低剂量组(P<0.01)；胸腺组织中IBDV载量分别降至(0.46±0.07)、(0.34±0.08)、(0.78±0.09)倍，高剂量组和中剂量组极显著低于模型组和低剂量组(P<0.01)，低剂量组显著低于模型组(P< 0.05)；法氏囊组织中IBDV载量分别降至 (0.59±0.11)、(0.44±0.05)、(0.80±0.10)倍，高剂量组和中剂量组极显著低于模型组 (P<0.01)，且显著低于低剂量组(P<0.05)，低剂量组显著低于模型组(P<0.05)。

3 讨论与结论

传染性法氏囊病常发生于3～12周龄的雏鸡或青年鸡，IBDV入侵后主要在免疫器官内大量繁殖，破坏免疫器官并导致机体免疫抑制，降低雏鸡的抗病能力和对疫苗的免疫应答能力，甚至引起死亡[1]。本研究中，中药提取物高、中、低剂量组雏鸡成活率分别达到86.67%、93.33%和 70.00%，高剂量组雏鸡脾脏指数和法氏囊指数显著低于模型组和低剂量组(P<0.05)，中剂量组胸腺指数和法氏囊指数显著低于模型组 (P<0.05)，说明中药提取物能有效缓解由于IBDV感染引起的免疫器官炎症，改善雏鸡免疫系统的调节作用，降低雏鸡的死亡率。本研究中，中药提取物由女贞子、黄芪、枸杞子、菟丝子等中药组方后提取制备而成，含有大量的黄芪多糖、枸杞多糖、女贞子多糖等生物活性物质，其作用机制可能是这些生物多糖具有增强免疫系统功能、营养免疫器官的功效，从而改善了IBDV感染引起的损伤，增强机体的抗病能力，达到提高雏鸡成活率的效果。

IBDV在雏鸡体内的生长繁殖与机体的抵抗能力存在一定的对抗关系。IBDV入侵雏鸡后，在肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊、胸腺等组织中广泛分布并繁殖，造成组织损伤和功能抑制。本研究采用中药提取物防治的雏鸡，IBDV在组织中的生长繁殖发生改变，高剂量组雏鸡的肾脏组织全部转为阴性，脾脏组织部分转为阴性，中剂量组雏鸡的肾脏组织全部转为阴性，脾脏和法氏囊组织部分转为阴性。分析IBDV在脾脏、胸腺和法氏囊组织中的载量，中药提取物高剂量组和中剂量组雏鸡的脾脏、胸腺、法氏囊中载毒量极显著低于模型组(P<0.01)，脾脏、胸腺组织中病毒载量极显著低于低剂量组(P<0.01)，法氏囊组织中病毒载量显著低于低剂量组(P<0.05)，提示中药提取物可以促进机体清除IBDV。在雏鸡清除病毒的过程中，中药提取物可以通过调节机体分泌大量的细胞因子参与免疫调节和抗病毒作用，中药提取物中含有大量的多糖，黄芪多糖可以促进鸡脾淋巴细胞分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6等多种细胞因子[15]，枸杞多糖可以提高雏鸡的免疫力，增强IL-2、IL-6基因mRNA的表达[16]。这些细胞因子主要由Th1和Th2分泌，在抗病毒过程中积极调节细胞免疫，增强机体的抗病毒能力[7]。但是部分雏鸡的免疫器官中IBDV仍然为阳性，尤其是低剂量组，由此可以推断该中药提取物对病毒的清除与药物使用剂量存在一定的关系，较低剂量的中药提取物对IBDV感染雏鸡的防治效果不佳，临床中防治IBDV时要制定鸡场的科学用药程序，有助于提高IBD的防治效果。