辽宁省苹果轮纹病病原菌鉴定及苹果品种（系）对其抗性的评价*

黄金凤，王冬梅，吕天星，闫忠业，王颖达，杨 锋，刘 志

（辽宁省果树科学研究所，营口 115009）

目前，我国是世界上苹果栽培面积最大、总产量最高的国家[1]。苹果轮纹病是我国苹果主产区危害最严重、发生最普遍的三大苹果病害之一[2]。苹果轮纹病主要分布于中国、日本、韩国等亚洲国家[3-5]。Xu 等[6]研究发现，我国苹果轮纹病由2 种主要病原引起，即葡萄座腔菌（B.dothidea）和粗皮葡萄座腔菌（B.kuwatsukai）。轮纹病菌是胁迫相关病原体，在洪涝、干旱等不适宜条件下，可导致宿主出现感染症状[7-8]。该病菌不仅能够侵染枝干，导致枝干粗皮或溃疡，从而出现树体衰弱现象，还能侵染果实，形成同心轮纹病斑，导致果实腐烂[9]，严重影响苹果的产量和品质。在我国，苹果轮纹病最早于1928 年被发现，随着易感苹果轮纹病苹果品种‘富士’的大面积推广，苹果轮纹病发病率增加，我国苹果产业遭受巨大的经济损失[10]。植物病害的发生与其生态环境是密切相关的，不同的生态环境常造成病原的变化或变异[11]，从而出现不同地理种群的菌株毒力不同的现象[12-13]。为明确苹果轮纹病病原菌的种类，本研究开展辽宁省熊岳地区病原菌的分离鉴定，及苹果品种（系）对苹果轮纹病抗性评价工作，为其防治及抗病品种改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2016 年和2018 年在辽宁省营口市鲅鱼圈区熊岳镇进行。供试菌株分离自辽宁省果树科学研究所苹果育种课题组实验基地苹果树。病原菌采自辽宁省果树科学研究所10 年生苹果树主干。用手术刀片切取病健交界处的组织，采用常规组织分离法分离病原菌[14]。

苹果轮纹病抗性评价的材料包括苹果品种8个，‘岳冠’‘岳阳红’‘岳华’‘岳艳’‘岳苹’‘望山红’‘寒富’‘鸡冠’；决选优系8 个，15-26、23-42、23-63、26-34、29-24、58-34、62-45、74-178。

1.2 病原菌鉴定

（1）形态学鉴定。病原菌在PDA 平板上培养5～7 d，逐日观察记录培养特征，挑取分生孢子进行显微形态观测，记录形状及大小。

（2）致病性测定。选取1 年生苹果新梢，用75%的酒精擦拭，风干。用10 cm 长的滤纸条蘸取孢子悬液，浓度105个/mL，包裹于新梢上保湿7 d，以接种无菌水的1 年生枝条为对照，观察发病情况。

（3）病原菌的分子鉴定。用解剖刀刮取PDA培养基表面菌丝，液氮中充分研磨成粉末，CTAB 法提取基因组DNA。采取通用引物ITS1 和ITS4，对病菌的ITS 区进行PCR 扩增[15]。25 μL PCR 反应体系：2× Es Taq Master Mix 12.5 μL、DNA 模板1 μL（50 mg/L）、上下游引物各 1 μL（10 pmol/L）、ddH2O 9.5 μL。PCR 反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，退火 60 s，72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。用DNA 凝胶回收试剂盒，回收目的片段；pMD18-T 载体克隆该片段；送公司测序；并开展序列分析[14]。

1.3 苹果品种（系）抗苹果轮纹病鉴定

（1）田间自然发病调查。2016 年和2018 年苹果树休眠期，记录材料树干的自然发病情况[13]。分级标准为：0 级，免疫，基本无病；1 级，高抗，轻微感病，主干上病斑呈分散状；2 级，中抗，感病较轻，主干上少部分病斑连片，主枝病斑呈分散状；3 级，中感，感病较重，主干上有较多病斑，主枝上少部分病斑连片；4 级，高感，严重感病，主干、主枝上病斑多已连片，侧枝病斑较多，呈分散状。

（2）人工接种抗性鉴定。方法同田间自然发病调查，10 月末调查新梢发病情况。病情分级与种质资源抗病评价标准参考杨华等[16]，略有改动。

病情指数＝［∑（发病枝数×相应级值）/（调查总枝数×4）］×100

根据病情指数，利用SPSS 软件采用K-means cluster 方法进行聚类分析，并结合不同病级枝条的分布情况，确定抗性评价标准：高抗，病情指数＜30；中抗，病情指数30～49；中感，病情指数50～64；高感，病情指数≥65。

2 结果与分析

2.1 苹果轮纹病病原菌的形态特征

生长在PDA 培养基上的菌落圆形，无褶皱，气生菌丝生长较密集，初期白色，生长后期变为灰白色至黑色，背面可见黑色色素沉着。刮除气生菌丝，置于黑光灯下培养，菌落表面可产生颗粒状子实体，墨绿色至黑色，较坚硬，突起于培养基表面，分生孢子无色，单胞，纺锤形，长18.6～25.0 μm，宽3.3～6.0 μm（图1）。

鉴定结果表明，该病原菌的形态特征、培养性状基本符合魏景超[17]提出的关于苹果轮纹病病原菌的分类标准，认为该病原菌为葡萄座腔菌（B.dothidea）。

图1 苹果轮纹病病原菌菌落及其分生孢子的形态特征

2.2 分离菌株的致病性

病菌孢子喷雾接种于苹果新梢，1 个月左右发病，症状与田间症状相同（图2），即发病初期，以皮孔为中心形成褐色凸起圆形小病瘤，病瘤致密，直径0.7～1 mm，并逐步扩大，随着时间推移，枝条增粗，严重的病瘤连成片。对回接发病的组织进行分离后，能够重新获得该原病菌，符合柯赫氏法则，表明分离的菌株即为苹果轮纹病的致病菌。

2.3 菌株的ITS 序列分析

通过PCR 扩增，得到736 bp 的特异性片段。经BLAST 比对，与Botryosphaeria dothidea相似性最高，为94%。形态学观察、致病性测定及分子生物学鉴定均表明，分离出的病原菌为引起轮纹病的葡萄座腔菌（B.dothidea）。

2.4 苹果品种（系）抗轮纹病鉴定

图2 感染苹果轮纹病的苹果枝干

从表1 可以看出，试材病情指数为21.3～92.5。其中高抗材料2 份，分别是‘鸡冠’、74-178；中抗材料4 份，分别是‘岳冠’‘岳阳红’‘寒富’和62-45；中感材料4 份，分别是‘岳华’‘岳苹’、23-42、29-24；高感材料6 份，分别是‘望山红’‘岳艳’、15-26、23-63、26-34、58-34。

2016 年田间调查整体发病较轻，其中，高抗材料5 份，占31.3%；中抗材料7 份，占43.8%；中感材料2 份，占12.5%；高感材料2 份，占12.5%（表1）。2018 年高感材料的鉴定结果与2016 年一致（‘望山红’、15-26），但抗病材料数量略有下降，感病材料数量略有增加。

比较人工接种和田间发病结果，完全一致的材料有8 份，包括‘鸡冠’和74-178 2 份高抗材料，‘岳阳红’和62-45 2 份中抗材料。就人工接种和田间调查的一致率来看，随着调查时间的延长，一致率逐渐提高，2016 年为50.0%，2018 年为75.0%。

表1 苹果品种（系）对B.dothidea 菌株的抗性

3 讨论与结论

3.1 苹果轮纹病病原菌的鉴定

苹果轮纹病是影响苹果生产的重要病害，给苹果产业造成了严重的经济损失。苹果轮纹病菌在世界范围内分布广泛，种类与寄主众多，其准确鉴定对于病害的流行及防控具有重要意义[18]。据报道，我国苹果轮纹病由2 种主要病原引起，即葡萄座腔菌B.dothidea和粗皮葡萄座腔菌B.kuwatsukai[6]。葡萄座腔菌引起病瘤小，可表现为溃疡症状；粗皮葡萄座腔菌引起病瘤大，最后发展成为粗皮症状[19]。本研究通过病原菌分离、形态特征观测、rDNA-ITS序列测定，对辽宁熊岳苹果枝干轮纹病病原菌进行了鉴定，明确了该病病原为葡萄座腔菌。研究结果与Liu[20]和Wang[21]等一致，为苹果轮纹病的防治提供一定参考。

3.2 苹果品种（系）对苹果轮纹病的抗性鉴定

田间调查表明，同一材料不同年份间的抗性存在差异。如2016 年的‘岳冠’和‘寒富’表现高抗，而2018 年调查结果表现为中抗。这可能是由于田间自然发病情况难以控制，温度、湿度、降水等都会影响到苹果轮纹病的发生与为害。并且，随着苹果树在田间栽植年份的延长，病害发生逐渐加重[13]。通过人工接种与田间自然发病调查的综合评价，筛选出‘鸡冠’、74-178 等2 份稳定高抗轮纹病材料，可作为抗病育种的亲本进一步杂交利用。