Bcl-2、miR-451和Th17细胞在食管癌中的诊断价值及其与复发的关系

陈恋恋，朱春凯，郑培明

CHEN Lianlian1 ,ZHU Chunkai2 ,ZHENG Peiming2

1.Department of Laboratory,Affiliated Hospital of He'nan Academy of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450000,China; 2.Department of Laboratory,He’nan People's Hospital,Zhengzhou 450000,China

0 引言

食管癌是临床常见消化道肿瘤之一，其发生与遗传、饮食习惯、环境等多种因素有关[1]。此疾病患病情况在中国呈地域性差异，一定区域绝对高发率与附近地区相对低发率形成鲜明对比，是中国食管癌典型的流行病学特征[2]。尽管近年食管癌诊断、治疗技术不断进步，但预后仍较差，中晚期患者5年生存率不足20%[3]。因此，继续加强食管癌早期诊断、预后评估，为临床完善针对性治疗方案提供客观依据是当前研究热点、重点之一。已有研究显示，食管癌病因、机制与细胞凋亡、炎性反应等多种因素协同作用有关[4]。B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）是凋亡相关基因家族主要成员之一，在恶性细胞增殖、凋亡中发挥关键调控作用，参与多种恶性肿瘤的演变过程[5]；微小RNA-451（miR-451）是病理状态下机体组织细胞重要组成部分，已有研究表明，其在食管癌中存在异常表达情况[6]；辅助性T细胞17（Th17细胞）是近年新发现的CD4+T细胞亚群成员，能特异性分泌IL-17介导机体炎性反应，可能与炎性反应相关性肿瘤形成有关[7]。目前鲜见外周血Bcl-2、miR-451和Th17细胞在食管癌患者中表达的相关研究，本研究旨在为临床完善诊断机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年10月—2018年10月河南省中医药研究院附属医院收治的101例食管癌患者作为研究组，另选取95例健康体检者作为对照组。纳入标准：经病理初次确诊，未经任何免疫治疗、抗肿瘤治疗；健康体检者经查体无器质性病变疾病，健康状态良好；所有患者的签署知情研究同意书。排除标准：继发性食管癌患者；存在免疫系统疾病者；伴感染性疾病者。研究组男62例，女39例，年龄38～75岁，平均61.89±5.26岁，体质量指数18～24 kg/m²，平均20.96±1.13 kg/m²；对照组男58例，女37例，年龄39～76岁，平均62.16±5.08岁，体质量指数18～24 kg/m²，平均21.03±1.08 kg/m²。两组年龄、性别、体质量指数基础资料均衡可比（均P＞0.05）。本研究经伦理委员会审批通过。

1.2 方法

检测方法：（1）Th17细胞检测：乙二胺四乙酸抗凝管取静脉血2 ml，全自动流式细胞仪（贝克曼库尔特，CytoFLEX型）检测Th17细胞水平；（2）Bcl-2检测：非抗凝管取静脉血2 ml，离心15 min（半径8 cm，转速3 500 r/min）取上清液，Bcl-2酶联免疫吸附法试剂盒（上海沪震生物科技有限公司）检测Bcl-2水平；（3）miR-451检测：取上清液，荧光测量法试剂盒提取RNA，脱洗后进行反转录，合成目的基因，采取荧光测量法检测miR-451水平。

治疗方法：根据不同患者食管癌分期、侵犯程度选取不同的治疗方法，包括食管癌根治术、食管癌根治术联合放化疗治疗或单纯放化疗治疗。

随访方法：随访1年，患者自治疗周期结束开始随访计时1年随访终止，采用电话或门诊形式进行随访。研究组失访5例，18例复发，78例未复发。

1.3 观察指标

（1）对比两组外周血Bcl-2、miR-451和Th17细胞水平；（2）对比研究组不同临床病理特征患者外周血Bcl-2、miR-451和Th17水平；（3）Pearson相关性系数分析分化程度、临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移与外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平相关性；（4）受试者工作特征（ROC）曲线分析外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平单一或联合诊断食管癌的价值；（5）随访1年，对比复发、未复发患者外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平；（6）ROC曲线分析外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞单一或联合预测食管癌复发的价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS21.0统计分析软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，两组间比较采用χ2检验。Pearson相关性系数分析相关性；ROC曲线分析诊断及预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血指标水平

研究组外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组各外周血指标水平 ()Table 1 Peripheral blood index levels of two groups ()

表1 两组各外周血指标水平 ()Table 1 Peripheral blood index levels of two groups ()

2.2 研究组不同临床病理特征与外周血指标水平的关系

随分化程度降低、临床分期升高、淋巴结转移、肿瘤直径增加外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平呈升高趋势（均P＜0.05），见表2。

2.3 研究组不同临床病理特征与外周血指标水平相关性分析

研究组患者分化程度、临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移与外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平呈正相关（均P＜0.05），见表3。

2.4 各外周血指标单一或联合诊断食管癌的价值

ROC曲线分析得到，外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞联合诊断食管癌的AUC值最大，为0.850（95%CI:0.792～0.897），敏感度及特异性分别为73.27%、90.53%；其次为Th17细胞，AUC为0.803（95%CI:0.741～0.857），当临界值＞3.63%时，敏感度及特异性分别为59.41%、88.42%；Bcl-2的AUC为0.792（95%CI:0.729～0.847），当临界值＞6.40 ng/ml时，敏感度及特异性分别为57.43%、55.79%；miR-451的AUC为0.717（95%CI:0.649～0.779），当临界值＞1.17时，敏感度及特异性分别为78.22%、55.79%，见图1。

2.5 复发及未复发患者各外周血指标水平

复发患者外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平高于未复发患者（均P＜0.05），见表4。

2.6 各外周血指标与复发关系

控制分化程度、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移等其他因素后，外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平与复发显著相关（均P＜0.05），见表5。

图1 各外周血指标单一(A)及联合(B)诊断食管癌的价值Figure 1 Value of each peripheral blood index for single(A) and combined(B) diagnoses of esophageal cancer

表2 研究组不同临床病理特征与外周血指标水平的关系 ()Table 2 Relation between different clinicopathological characteristics and peripheral blood index levels in experimental group ()

表2 研究组不同临床病理特征与外周血指标水平的关系 ()Table 2 Relation between different clinicopathological characteristics and peripheral blood index levels in experimental group ()

表3 研究组不同临床病理特征与外周血指标水平相关性分析Table 3 Correlation of different clinicopathological characteristics and peripheral blood index levels in experimental group

表4 复发及未复发患者各外周血指标水平 ()Table 4 Peripheral blood index levels of relapsed and nonrelapsed patients ()

表4 复发及未复发患者各外周血指标水平 ()Table 4 Peripheral blood index levels of relapsed and nonrelapsed patients ()

表5 各外周血指标与复发关系Table 5 Relation between peripheral blood parameters and recurrence

3 讨论

食管癌属我国多发恶性肿瘤之一，早期隐匿性强，多数患者确诊时已进展至中晚期，丧失最佳根治时机[8]。从细胞分子生物学层面加强食管癌早期筛查、诊断机制对临床具有重要意义。

miR-451是外周血中小分子非编码RNA，参与调节多种细胞凋亡过程。病理研究显示，miR-451结合靶信使RNA后可控制、影响mRNA翻译过程，继而加快机体健康细胞凋亡，诱导癌性因子释放，同时还参与恶性肿瘤生物学行为及耐药基因调控[9]。本研究显示，研究组外周血miR-451水平高于对照组，提示外周血miR-451水平升高可能与食管癌发病、发展有关。但荣忠厚等[10]检测107例胃癌组织中miR-451表达，发现组织内miR-451表达下调患者生存时间较上调患者显著缩短。本研究结论与此不一致，分析可能是因检测靶部位不同，miR-451主要介导细胞凋亡过程，随细胞凋亡、裂解会释放入血，而在外周血中miR-451能逃避RNA酶降解而长时间稳定存在，并随凋亡细胞增多呈升高趋势。陈志平等[11]报道中也表明，miR-451在结肠癌患者外周血中呈高表达，诊断早期原位结肠癌的阳性率为88%。进一步ROC曲线分析显示，外周血miR-451诊断食管癌的敏感度为78.22%，特异性为55.79%，提示其可为临床诊断提供一定参考依据。

Bcl-2是当前已发现与凋亡密切相关的原癌基因之一，阻滞细胞凋亡的作用主要体现在延长细胞生存期，而非刺激细胞增殖。目前研究已证实，在多种恶性组织内Bcl-2过表达，采取Bcl-2小分子抑制剂可提高肿瘤细胞放疗敏感度，其机制是阻断Bcl-2所参与线粒体途径细胞凋亡过程而提高放疗效果[12]。有研究显示，胃癌组织Bcl-2阴性表达患者经放化疗完全缓解率较高[13]。本研究显示，研究组外周血Bcl-2水平高于对照组，提示外周血Bcl-2可能参与食管癌发病过程。有研究采用三维适形精确放射治疗50例食管癌，结果发现，外周血Bcl-2水平与疗效无相关性，得出结论外周血Bcl-2可能与食管癌发病发展无密切关系[14]。进一步对比发现，随分化程度降低、临床分期升高、淋巴结转移、肿瘤直径增加外周血Bcl-2水平呈升高趋势，Pearson相关性系数分析，外周血Bcl-2水平与分化程度、临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移呈正相关（P＜0.05），证实外周血Bcl-2水平与食管癌患者发病发展关系密切。与上述研究结论不一致，可能是因其例数较少，缺乏代表性，本研究进一步扩大样本量可客观反映不同患者Bcl-2表达的差异。

Th17细胞是近年肿瘤免疫层面研究的热点方向。研究证实，Th17细胞及其效应因子IL-17能促进肿瘤病理进展，导致患者生存期缩短，预后较差[15-16]。有研究报道了Th17细胞在恶性肿瘤中的特征及表现，进展期黑色素瘤鼠模型中Th17表现高水平，除病灶引流淋巴结外，在骨髓、脾脏、外周血中Th17细胞占比显著升高[17]。进一步研究证实，在人体恶性肿瘤内Th17分布与鼠模型一致[18]。本研究亦发现，食管癌患者外周血Th17细胞水平显著升高，且随分化程度降低、临床分期升高、淋巴结转移、肿瘤直径增加其水平呈升高趋势。分析原因可能是：（1）食管癌微环境内恶性细胞可分泌促Th17细胞增殖必需因子，促进Th17细胞增殖、分化；（2）恶性细胞所分泌CCL20趋化因子可特异性结合Th17细胞表面受体CCR6，刺激Th17细胞在病灶局部增殖，并致外周血Th17细胞水平升高。相关性分析显示，外周血Th17细胞水平与食管癌分化程度、临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移呈正相关，证实外周血Th17细胞与食管癌发病发展关系密切，可为临床诊断提供参考依据。

此外，食管癌患者预后5年生存率较低，其预后评价亦是临床重点内容之一，本研究发现，复发患者外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平高于未复发患者，且在控制分化程度、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移等其他因素后，外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞水平仍与复发显著相关，说明外周血Bcl-2、miR-451、Th17细胞异常表达可能是预后复发率高的主要原因之一，可能与三者均具有介导健康细胞凋亡、促进恶性组织生长、降低恶性细胞分化能力等原因有关。

综上，食管癌患者存在外周血B c l-2、miR-451、Th17细胞水平异常表达情况，且表达水平与分化程度、临床分期及复发等关系密切，联合检测可为临床诊断、预后评估提供客观依据，以便临床针对性制定治疗方案。