溶瘤呼肠孤病毒联合CD30/CD16A双特异性抗体对NK细胞介导的ADCC效应的影响*

廖春香，龙世棋，安媛媛1，，车启元1，，王念雪1，，陈亮，杨薇，赵星*

(1.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学 基础医学院 免疫学教研室，贵州 贵阳 550004；3.安顺市人民医院 胸甲乳外科，贵州 安顺 561000；4.贵州医科大学 临床医学院 肿瘤学教研室，贵州 贵阳 550004)

双特异性抗体是由人工构建的在同一抗体分子上可同时特异性结合两个不同抗原分子的一类抗体，抗体一端可通过与自然杀伤(natural killer，NK)细胞的FcγRIII结合，另一端可与靶细胞结合后促进NK细胞对靶细胞的杀伤作用[1-4]。CD30/CD16A作为一种4价的BsAbs，含有2个CD16A结合位点及2个CD30结合位点，使其在特异性连接CD30分子阳性的肿瘤细胞的同时又能特异性连接CD16A阳性的NK细胞，从而通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)杀伤CD30分子阳性的肿瘤细胞[5]。正常情况下，CD30分子低表达于激活的B淋巴细胞和T淋巴细胞，长期被认为是经典霍奇金淋巴瘤(hodgkins lymphoma，HL)的表面分子标志[6]，但近期研究发现非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)如间变性大细胞瘤中也有表达，且已成为CD30分子阳性的淋巴瘤患者抗体治疗的理想靶点[6]。由于BsAbs的功能发挥主要依赖于NK细胞的抗肿瘤活性，因而目前很多研究都是围绕如何增强NK细胞功能来促进BsAbs的疗效[7]。本课题组前期研究工作中已发现，溶瘤呼肠孤病毒(reovirus)不仅可以促进NK细胞的抗肿瘤活性[8]，在联合西妥昔单抗后进一步增强NK细胞介导的ADCC作用，进而抑制裸鼠肿瘤的生长[9]。因此，本研究通过体外实验检测reovirus联合(CD30/CD16A)BsAbs对于NK细胞抗肿瘤活性的影响，从而为探索NHL等淋巴瘤的治疗新策略奠定理论及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株和病毒 高表达CD30分子的人间变性大细胞瘤KARPAS-299细胞株、高表达CD20分子的人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株、人结直肠癌DLD-1细胞株及reovirus 3型(Type 3 dearing，T3D)均由本实验室保存。

1.1.2主要试剂和仪器 人NK细胞分离试剂盒(德国Miltenyi Biotec)，人外周淋巴细胞Ficoll分离液(英国GE)，DNaseⅠ(中国 Solarbio)，流式抗体抗人FITC-anti CD3、抗人PE-anti CD56、抗人APC-anti CD69及抗人APC-anti CD107a抗体(美国Biolegend)，抗人FITC-anti CD30抗体(美国BD)，荧光二抗FITC-IgG(美国Jackson Immuno Research)，CD30/CD16A BsAbs(美国斯坦福大学Holbrook Kohrt教授惠赠)，PRMI1640培养基、低限量Eagle培养基(minimum Eagle’s medium，MEM)培养基、青霉素及链霉素、胰酶(美国Sigma-Aldrich)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；美国Gibco)，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒(美国Biovision)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS；美国Sigma-Aldrich)；多功能酶标仪SYNERGY H1(美国Bio Tek)，FC500分析型流式细胞仪(美国Beckman)，CO2细胞恒温培养箱(美国Thermo Fisher)，倒置显微镜(日本Nikon)，5810低温离心机(德国Eppendorf)，-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo Fisher)，生物安全柜(山东Biobase生物)。

1.2 方法

1.2.1人NK细胞的分离、纯化及鉴定 采集健康献血者肝素抗凝静脉血30 mL，按1 ∶1的体积比加入生理盐水稀释血液，混匀备用；50 mL离心管内加入淋巴细胞分离液25 mL，各管分别加入稀释后的血液20 mL，2 500 r/min离心10 min，取中间白膜层即为分离出的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，生理盐水清洗2次，去除上清，加磁珠分选缓冲液(magnetic-activated cell sorting buffer，MACS buffer)500 μL重悬，按每1×107个NK细胞加Biotin-antibody 10 μL的比例将二者混匀，4 ℃孵育5 min，加MACS buffer 30 μL及NK细胞MicroBead 20 μL，4 ℃孵育10 min，MACS buffer将体积调整为500 μL后用200目过滤器除去细胞团块，将过滤后的细胞经免疫磁珠筛选，分离获得的NK细胞立即使用或于液氮中保存，1个月内使用。

1.2.2LDH释放法检测reovirus活化的NK细胞抗肿瘤活性 从液氮罐中复苏NK细胞，分别与10及100 感染复数(multiplicity of infection，MOI)的reovirus于37 ℃的5%CO2温箱中孵育过夜(Reo-NK组)；次日取出细胞调整浓度至3×103个/L，以Reo-NK或未经reovirus处理的NK为效应细胞、DLD-1为靶细胞，按效靶比为5 ∶1的比例加Reo-NK/NK及DLD-1细胞，同时设实验孔(效靶细胞各100 μL)、靶细胞自然释放孔(靶细胞及培养基各100 μL)、靶细胞最大释放孔(靶细胞100 μL及Triton液各100 μL)及效应细胞自然释放孔(靶细胞及培养基各100 μL)；细胞培养板置于温箱中孵育3.5 h，孵育结束前30 min在靶细胞最大释放孔中加入裂解液10 μL充分混匀；多孔板离心机1 200 r/min离心5 min，取上清液，加到标记好的新96孔板中，每孔加LDH工作液50 μL，混匀置于室温避光孵育30 min；用酶标仪于490 nm处检测光密度值(optical density，OD)，并计算DLD-1细胞的死亡率(killing rate)[死亡率(%)=(实验孔OD值-靶细胞自然释放孔OD值-效应细胞自然释放孔OD值)/(靶细胞最大释放孔OD值-靶细胞自然释放孔OD值)×100%]。

1.2.3流式细胞术检测KARPAS-299细胞膜表面CD30分子的表达 取1×106个KARPAS-299细胞，900 r/min离心5 min，去除上清；加入流式缓冲液1 mL重悬洗涤，1 200 r/min离心5 min，弃上清；加入Fc封闭液5 μL室温孵育20 min，分别对应加入抗人APC-CD30及同型对照抗体IgG1各5 μL，避光孵育30 min，加1×PBS重悬后1 500 r/min离心8 min，去除上清液；加1×PBS约500 μL重悬细胞，经200目细胞筛过滤后用贝克曼FC500流式细胞仪检测KARPAS-299细胞膜表面CD30分子的阳性率，结果用Flowjo 10软件进行分析。

1.2.4Reo-NK联合CD30/CD16A对KARPAS-299细胞的杀伤效应 将NK细胞作为效应细胞用1 MOI的reovirus预处理(Reo-NK)，置细胞培养箱内培养12 h；KARPAS-299细胞作为靶细胞，将同型对照抗体IgG1或CD30/CD16A按不同浓度[(0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00及1 000.00)×10-12mol/L]与靶细胞共孵育2 h，靶细胞按6×104个/孔接于U型96孔反应板，NK/Reo-NK与KARPAS-299细胞及Raji细胞的效靶比均为1 ∶1，组别设置为NK+IgG1组、NK+CD30/CD16A组、Reo-NK+IgG1组及Reo-NK+CD30/CD16A组，同时设空白对照孔(RPMI1640 100 μL)、靶细胞自然释放孔(靶细胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、靶细胞最大释放孔(靶细胞50 μL+RPMI1640 50 μL+裂解液10 μL)、效应细胞孔(效应细胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、效应细胞自然释放孔(效应细胞50 μL+RPMI1640 50 μL)等对照组，置温箱中孵育4 h；孵育结束前30 min在靶细胞最大释放孔中加裂解液10 μL充分混匀；1 200 r/min离心5 min，收集上清液至新的96孔板中，加LDH工作液50 μL，充分混匀，置于室温避光孵育30 min；酶标仪于490 nm处检测OD，并计算死亡率。

1.2.5流式细胞术检测NK细胞表面分子的表达 流式细胞术检测不同滴度reovirus(0.0、0.1、0.5、1.0、10.0、100.0 PFU)及人结直肠癌DLD-1细胞对NK细胞活化标志物CD69分子、细胞毒性标志物CD107a分子表达的影响。具体操作：取1×107个NK细胞，设置为Reo-NK组和Reo-NK+DLD-1组，同时加不同滴度的reovirus过夜；次日Reo-NK+DLD-1组加入按5 ∶1的效靶比加入靶细胞DLD-1，孵育5 h；Reo-NK组及Reo-NK+DLD-1组均以900 r/min离心5 min，去除上清；加流式缓冲液1 mL重悬洗涤，1 200 r/min离心5 min，弃上清；加Fc封闭液5 μL室温孵育20 min，分别对应加抗人APC-CD69、抗人APC-CD107a、抗人PE-CD56及抗人FITC-CD3流式抗体各5 μL，避光孵育30 min，加1×PBS重悬后1 500 r/min离心8 min，去除上清液；加缓冲液500 μL重悬细胞，经200目细胞筛过滤后用贝克曼FC500流式细胞仪进行检测CD69及CD107a的阳性率，并用Flowjo 10软件进行结果分析。

1.2.6Reo-NK联合CD30/CD16A对Raji细胞的杀伤效应 将NK细胞作为效应细胞用1 MOI的reovirus预处理(Reo-NK)，置细胞培养箱内培养12 h；Raji细胞作为靶细胞与不同浓度[(0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00及1 000.00)×10-12mol/L]的CD30/CD16A 共同孵育2 h后，按6×104个/孔接于U型96孔反应板，按照1 ∶1的效靶比加入NK及Reo-NK细胞。实验设置为NK+CD30/CD16A组和Reo-NK+CD30/CD16A组，同时设空白对照组(RPMI1640 100 μL)、靶细胞自然释放组(靶细胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、靶细胞最大释放组(靶细胞50 μL+RPMI1640 50 μL+裂解液10 μL)、效应细胞组(效应细胞50 μL+RPMI1640 50 μL)及效应细胞自然释放组(效应细胞50 μL+RPMI1640 50 μL)，置温箱孵育4 h；孵育结束前30 min在靶细胞最大释放孔中加裂解液10 μL充分混匀；1 200 r/min离心5 min，收集上清液至新的96孔板中，加LDH工作液50 μL，充分混匀，置于室温避光孵育30 min；用酶标仪于490 nm处检测OD，并计算死亡率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NK细胞表型

流式检测结果显示，体外新鲜分离的NK细胞纯度及CD3-CD56+的细胞群可达70%以上。见图1。

图1 新鲜分离的NK细胞纯度

2.2 Reovirus促进NK细胞的抗肿瘤活性

LDH检测结果显示，与单独NK组相比，Reo-NK对DLD-1细胞的杀伤率明显增强，差异有高度统计学意义(P<0.01)。见图2。

注：(1)与NK组比较，P<0.01。

2.3 Reovirus、DLD-1细胞对NK细胞活化标注物CD69和细胞毒性分子CD107a表达的影响

流式检测结果显示，随着reovirus滴度的上升，NK细胞活化标志物CD69与其细胞毒性分子CD107a的表达呈上升趋势，且在同reovirus滴度下(100 PFU)经DLD-1处理的NK细胞表面的CD69及CD107a分子的阳性率相对未经DLD-1处理的NK细胞增加更为明显(P<0.05)。见图3。

注：与0.0 PFU组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；A为流式细胞仪检测十字门结果，B为流式检测的统计结果。

2.4 KARPAS-299表面VD30分子的检测及reovirus联合(CD30/CD16A)BsAb对NK细胞介导的ADCC效应的影响

LDH释放实验检测结果显示，NK+CD30/CD16A组与NK+IgG1组相比，对KARPAS-299细胞杀伤能力增强，差异有统计学意义(P<0.05)；Reo-NK+IgG1组与NK+IgG1组相比，对KARPAS-299细胞杀伤能力增强，差异有统计学意义(P<0.05)；Reo-NK+CD30/CD16A组与Reo-NK+IgG1组相比，对KARPAS-299细胞杀伤能力增强，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为KARPAS-299细胞表面CD30分子检测，B为reovirus联合不同浓度的(CD30/CD16A)BsAb对KARPAS-299细胞的杀伤作用检测结果；(1)与同浓度NK+IgG1组相比，P<0.05;(2)与同浓度Reo-NK+IgG1组相比，P<0.05。

2.5 NK细胞联合(CD30/CD16A)BsAb对Raji细胞的细胞毒作用

在未经reovirus处理的NK+CD30/CD16A组的抗肿瘤效应中，各浓度(CD30/CD16A)BsAb均未显著促进NK细胞对Raji细胞的杀伤效应，而经reovirus活化的NK+CD30/CD16A组对Raji细胞的杀伤效应显著(P<0.05)。见图5。

注：(1)与NK+CD30/CD16A组比较，P<0.05。

3 讨论

NK细胞是机体具有细胞毒性的免疫细胞之一，在体外可以通过白细胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)、IL-15、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等多种细胞因子活化[10-17]。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中发挥抗肿瘤效应的重要机制之一是ADCC作用[16, 18-20]。而CD16分子是NK细胞启动ADCC效应过程中是不可或缺的条件，在许多基于抗CD16抗体的肿瘤治疗中，由于只能特异性连接1个抗原靶点，其特异性相对较低且分子量小，易产生脱靶效应[21-24]。与之相比，由于双特异性抗体具有可同时特异性连接2种抗原靶点、连接稳定不易脱靶等优势，目前已成为治疗性抗体研究的热点[25-26]。据报道，目前已有80余种双特异性抗体正处于临床研究各阶段，其中包括世界首例批准上市的用于治疗恶性腹水的卡妥索单抗、后续上市的用于治疗肿瘤性腹水的EpCAM/CD3及用于治疗B型淋巴细胞白血病的CD19/CD3[4,24]等，在临床实验中，这些抗体均呈现出较好的靶向性和特异性。

本研究探讨了reovirus在NK细胞活化中的作用以及联合双特异性抗体(CD30/CD16A)BsAb对CD30分子阳性肿瘤细胞的作用。通过流式检测及杀伤实验发现reovirus可以活化NK细胞，促进NK细胞表面活化标志物CD69、CD107a分子的表达；流式细胞仪检测结果可见，KARPAS-299细胞CD30分子的阳性率为90%以上，呈高表达状态。同时，为了进一步验证(CD30/CD16A)BsAb对CD30高表达的肿瘤细胞KARPAS-299细胞的特异性，本研究将CD20+CD30-的Raji细胞作为对照，用reovirus预处理的NK细胞联合(CD30/CD16A)BsAbs后杀伤Raji细胞，通过LDH释放试验检测杀伤效应。实验结果显示增强NK细胞对人结直肠癌DLD-1细胞株、人间变性大细胞瘤KARPAS-299细胞株及人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株等多种肿瘤细胞的杀伤效应。在LDH释放试验检测KARPAS-299细胞死亡率实验中观察到：reovirus可以增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应，而(CD30/CD16A)BsAbs可以进一步促进NK细胞对KARPAS-299细胞的杀伤效应且与(CD30/CD16A)BsAbs呈浓度依赖性，但在同型对照IgG1组则未观察到NK细胞杀伤能力与抗体有关，如当CD30/CD16A及IgG1浓度同为1.00×10-12mol/L时，Reo-NK+CD30/CD16A组对KARPAS-299细胞的细胞毒作用较Reo-NK+IgG组显著；当CD30/CD16A及IgG1浓度均上升为10.00×10-12mol/L时，Reo-NK+CD30/CD16A组对KARPAS-299细胞的细胞毒作用较Reo-NK+IgG组显著，同样，当CD30/CD16A及IgG1浓度进一步上升至100.00×10-12mol/L时，Reo-NK+CD30/CD16A组对KARPAS-299细胞的细胞毒作用较Reo-NK+IgG组提高更为显著。此外，本研究结果显示，reovirus活化的NK细胞降低了NK细胞介导的ADCC效应所需的抗体量，如在细胞死亡率同为5%时，经reovirus活化的NK细胞仅需联合1.00×10-12mol/L的CD30/CD16A，而未经reovirus活化的NK细胞需联合100.00×10-12mol/L的CD30/CD16A才能达到相同杀伤效应。在(CD30/CD16A)BsAbs存在条件下，无论是NK细胞还是经reovirus活化的Reo-NK细胞，其杀伤效应均能随着(CD30/CD16A)BsAbs浓度的升高有不同程度的增强，特别是Reo-NK的抗肿瘤效应增加更显著，该结果表明reovirus不仅能促进NK细胞的抗肿瘤效应，还能联合(CD30/CD16A)BsAb通过NK细胞介导的ADCC效应进一步杀伤CD30阳性的KARPAS-299细胞且杀伤能力呈抗体浓度依赖性。在CD20+CD30-的Raji细胞杀伤试验中可以观察到：随着(CD30/CD16A)BsAbs浓度增加，NK细胞对Raji细胞的杀伤效应无显著增强，在reovirus活化的NK细胞中虽然杀伤效应显著上升，但未呈现出浓度依赖性，表明(CD30/CD16A)BsAbs在靶向分子CD30缺失情况下，不能促进NK细胞的抗肿瘤效应，该结果证明了(CD30/CD16A)BsAbs对CD30+的肿瘤细胞的杀伤具有特异性。

综上所述，reovirus不仅可以促进体外新鲜分离的NK细胞活化，增强其抗肿瘤效应，而且在联合双特异性抗体(CD30/CD16A)BsAbs后还能进一步促进NK细胞特异性识别高表达CD30分子的靶细胞，进一步增加NK细胞介导的ADCC作用。本研究结果仅显示体外实验研究的部分结果，双特异性抗体联合NK细胞抗肿瘤的具体机制研究尚未完成，在抗肿瘤中的安全性及有效性有待进行动物实验作进一步的研究，且体内的抗肿瘤效应比体外实验所能研究的复杂得多，还有很多体内实验有待完成。通过本次研究可为后续深入探索reovirus联合(CD30/CD16A)BsAbs抗肿瘤机制研究以及临床应用提供理论及实验基础。