SSR分子标记在玉米品种良玉88纯度鉴定上的应用

朱志成

(辽宁省农业发展服务中心省种业发展中心，辽宁 沈阳 110034)

玉米是我国的重要作物，在农业生产中占有重要地位。玉米种子质量直接影响产量，玉米种子纯度是评价种子质量的重要指标[1]。实践中，我国玉米种子纯度鉴定仍以籽粒形态鉴定、幼苗鉴定和田间小区种植鉴定为主体，辅以同工酶和蛋白质电泳技术[2]。

利用种子、幼苗或者株型等形态差异鉴定纯度的方法费时费力，受环境和基因显隐性等的影响较大，检测结果易出现偏差。同工酶和蛋白质电泳技术具有简单、快速、成本低等优点，然而，随着玉米品种数量的逐年增多，种质资源狭窄，同质化问题愈显突出，难以找到杂交种特征带，难以进行有效的品种纯度检测。

利用SSR分子标记技术对玉米品种纯度鉴定的优越性在于：SSR分子标记数量大，特异性高，可鉴定表型难于鉴别的品种；SSR分子标记不受任何环境因素的影响，可在生长发育的任何阶段取材鉴定；SSR分子标记呈共显性遗传，操作灵活、简便、快速，易于分析；利用SSR分子标记鉴定品种，不仅准确可靠，而且还便于实现标准化。

本研究利用20对SSR基本引物对玉米品种“良玉88”进行筛选，以期获得对玉米品种“良玉88”具有双亲互补带型的特异性引物，并对其进行纯度鉴定[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

本研究供试材料的玉米杂交品种“良玉88”及其双亲，由丹东登海良玉种业有限公司提供(见表1)。

表1 杂交种及其双亲

1.1.2 SSR基本引物

参考NY/T1432-2014标准，采用20对SSR基本引物[4,5]。

表2 20对SSR基本引物

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用植物基因组DNA分子试剂盒提取玉米单粒种子DNA。

1.2.2 PCR扩增

1.2.2.1 扩增体系

反应各组分见表3。

表3 扩增反应体系

1.2.2.2 PCR程序

PCR扩增反应程序：设置94℃，预变性5min，再进行循环扩增；在94℃条件下，运行40s；60℃条件下，运行35s；72℃条件下，运行45s；1次循环结束。扩增循环设置为35次，在72℃条件下，5min，扩增结束。在4℃条件下保存待测。

1.2.3 PAGE胶电泳

将PCR扩增产物，在4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶上，电泳分离观察扩增结果。先用PCR仪在94℃条件下，运行5min后，使DNA双链变性为单链。将制备好的4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶装上电泳槽，设置90W的恒功率，运行20min；再将变性的PCR扩增产物上样，设置80W的恒功率，运行40min，进行电泳分离SSR引物扩增出的DNA片段。用冰醋酸配制10%固定溶液，浸泡聚丙烯酰胺凝胶5min，进行固定，用AgNO3配制0.2%的染色溶液，浸泡聚丙烯酰胺凝胶5min，对上述DNA片段进行染色；将凝胶漂洗于双蒸水中2次，每次10s；用1.5%的NaOH和0.4%甲醛配制显影液，浸泡聚丙烯酰胺凝胶直至显影；用10%固定溶液固定。

2 结果

由图1所示，可以观察到umc1705w1引物扩增玉米品种“良玉88”和父母本的PAGE胶电泳图谱，1～3为父本S122的PCR扩展片段，1条较小的谱带，20～27为母本M54的PCR扩展片段，1条较大的谱带；umc1705w1引物扩增的父本谱带和母本谱带有明显差异；玉米品种“良玉88”的PCR扩展片段，有2条谱带，1条谱带与父本相同，1条谱带与母本相同。结果表明umc1705w1引物为玉米品种“良玉88”的具有亲本互补带型的特异性引物，可以鉴别玉米品种“良玉88”和其父母本双亲，表明umc1705w1引物可以对“良玉88”进行品种纯度鉴定。

由图2所示，可以观察到bnlg1702k1引物扩增玉米品种“良玉88”和父母本的PAGE胶电泳图谱，1～3为父本S122的PCR扩展片段，1条较大的谱带，20～27为母本M54的PCR扩展片段，1条较小的谱带；bnlg1702k1引物扩增的父本谱带和母本谱带有明显差异；玉米品种“良玉88”的PCR扩展片段，有2条谱带，1条谱带与父本相同，1条谱带与母本相同。结果表明bnlg1702k1引物为玉米品种“良玉88”的具有亲本互补带型的特异性引物，可以鉴别玉米品种“良玉88”和其父母本双亲，表明bnlg1702k1引物可以对“良玉88”进行品种纯度鉴定。

3 结论与讨论

本研究利用20对SSR基本引物对玉米品种“良玉88”进行筛选，获得umc1705w1引物和bnlg1702k1引物对玉米品种“良玉88”具有亲本互补带型的特异性，并对其进行纯度鉴定。在玉米品种制种过程中，由于田间管理不当、母本花期去雄不及时、父本砍除不净等原因，造成玉米杂交种中含有母本和父本籽粒，影响玉米大田产量。通过SSR分子标记技术对玉米品种进行品种纯度鉴定，要剔除偏父型和偏母型的引物，既只能区别父本和杂交种或母本和杂交种的引物，不具有亲本互补带型特征。同时，品种纯度鉴定所选的引物还要具有较高的等位基因频率，这样有利于异品种的鉴定。本研究不仅为玉米品种遗传图谱的建立奠定基础，同时也为玉米品种基因定位提供参考。