非诺贝特联合双环醇治疗非酒精性脂肪性肝病患者肝组织PPARγ2 mRNA水平变化*

李 钊，黄赞松，李 繁

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)为饮酒以外的多种原因所致的肝脏脂肪堆积，表现为慢性肝组织脂肪沉积和慢性炎症等脂质代谢紊乱的一系列临床和病理学综合征[1]。目前，针对NAFLD尚无特效的疗法。双环醇为联苯双酯结构类似物，既往研究[2]显示其可清除自由基、避免肝细胞核DNA受损、维持肝细胞膜稳定性，进而避免肝细胞凋亡，为临床常用的护肝药物，但其对NAFLD患者肝细胞内脂质蓄积的改善作用不强。非诺贝特为第三代苯氧乙酸类调血脂药物，可抑制胆固醇吸收及其体内合成，并促进其转运，广泛应用于处理高血脂和高血糖，发现其能调节机体的血脂代谢紊乱[3，4]。非诺贝特能诱导脂肪酸氧化、维持胰岛素敏感性，其作用与核受体转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)有关[5]。PPARs gamma 2(PPAR-γ2)是PPARs的亚型之一，可调节脂肪细胞增殖分化和脂肪代谢。本研究应用非诺贝特联合双环醇治疗NAFLD患者，观察了疗效及肝组织PPARγ2水平的变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2018年2月～2019年12月我院收治的NAFLD患者66例，男34例，女32例；年龄32～71岁，平均年龄为(53.4±5.7)岁；病程0.5～11年，平均为(6.2±1.8)年；体质指数(body mass index，BMI)为20.2～31.5 kg/m2，平均为(26.3±2.2)kg/m2。符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[6]的诊断标准，合并腹型肥胖50例。排除标准：女性饮酒乙醇摄入量>70 g/周，男性乙醇摄入量>140 g/周，排除病毒性肝炎、药物性肝损伤、肝豆状核变性、自身免疫性疾病、伴有严重的感染、合并贫血、存在肝脏手术史、滥用药物或毒品史、入组前2月内接受过益生菌或调脂降糖药物治疗、对双环醇或非诺贝特过敏。采用随机数字表法将患者分成两组，每组33例，两组性别、年龄、病程、BMI和合并腹型肥胖等一般资料比较无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究方案已经获得我院医学伦理委员会审核批准，患者签署知情同意书。

1.2 治疗方法 两组均控制饮食，避免高热量高蛋白食物摄入，禁烟酒，进行适当体育锻炼，保持血糖和血压平稳。在对照组，给予双环醇片(北京协和药厂，国药准字H20051712)50 mg口服，3次/d；观察组在对照组治疗的基础上给予非诺贝特片(迪沙药业集团有限公司，国药准字H37022898)0.1口服，1次/d。两组均持续用药3个月。

1.3 肝组织PPARγ2mRNA检测 常规肝穿刺，取得肝组织。采用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取肝组织总RNA，使用M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)合成cDNA，采用荧光定量聚合酶链式反应检测PPARγ2mRNA，经内参基因进行校正后获得其相对水平(PPAR-γ2总拷贝/GAPDH总拷贝)。采用荧光定量聚合酶链式反应检测PPARγ2mRNA，上游引物序列为5′-ATTTTCTGGAGAGCT-TGGC-3′，下游引物序列为5′-GT-GAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′，经内参基因进行校正后获得其相对水平(PPAR-γ2总拷贝/GAPDH总拷贝)。

1.4 血清检测 使用全自动生化分析仪检测血生化指标(宁波医杰生物科技有限公司)；采用化学发光免疫分析法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平(苏州长光华医生物试剂有限公司)和白介素-6(interleukin-6, IL-6)水平(北京普恩光德生物科技开发有限公司)；采用免疫比浊法检测血清超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)水平(武汉明德生物科技股份有限公司)；使用FC500型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特)检测外周血CD3、CD4和CD8细胞百分比。

1.5 疗效判断 显效：症状及体征消失或明显改善，肝功能和血脂指标复常，B超检查显示肝脏形态学复常或脂肪肝程度缓解，CT表现为肝/脾比值>1.0；有效：症状及体征消失或明显好转，肝功能和血脂指标较治疗前下降1/2以上，B超检查显示脂肪肝程度缓解，CT检查表现为脂肪变程度缓解；无效：症状及体征无明显好转，肝功能和血脂各项指标未下降，B超和CT检查表现未达到有效标准[7]。

2 结果

2.1 两组疗效比较 在治疗结束时，观察组显效17例(51.5%)，有效15例(45.5%)，无效1例(3.0%)；对照组显效8例(24.2%)，有效14例(42.4%)，无效11例(33.3%)。观察组总有效率为97.0%，显著高于对照组的66.7%，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 两组肝组织PPARγ2mRNA水平比较 治疗后，观察组肝组织PPARγ2mRNA水平为(1.5±0.1)，显著高于对照组【(1.1±0.2)，P<0.05】。

2.3 两组血清炎性因子水平比较 在治疗后，观察组血清炎性因子水平显著低于对照组(P<0.05，表1)。

2.4 两组外周血淋巴细胞亚群水平比较 在治疗后，观察组外周血CD3、CD4细胞百分比和CD4/ CD8细胞比值显著高于对照组(P<0.05，表2)。

表1 两组血清炎性因子水平比较

表2 两组外周血淋巴细胞亚群比较

3 讨论

随着经济生活和饮食结构的改变，肥胖及代谢性疾病发病率呈上升趋势。研究显示NAFLD作为获得性代谢应激性肝损伤，发病群体具有低龄化发展趋势，已经成为国内第一大慢性肝病[8]。成年人NAFLD发病率为6%～45%。NAFLD患者并发肝细胞癌风险显著增加，严重威胁公共健康[9]。如何科学有效地处理NAFLD患者成为临床亟待解决的问题。目前，NAFLD 尚无公认的特效治疗药物，治疗的首要目标为降低体脂和肝脏脂肪沉积，避免因“二次打击”而导致肝纤维化病情进展，降低二型糖尿病和代谢综合征等合并症的发生。双环醇为我国自主研发的护肝药物。研究[10]显示双环醇可调控药物代谢酶活性、促进化学毒物和致癌物代谢，起到护肝的效果。非诺贝特则可通过调节胆固醇代谢、改善胰岛素抵抗，发挥综合调节机体代谢的作用。本研究将非诺贝特和双环醇联合应用于治疗NAFLD患者，发现能短期改善患者各项指标。

目前，NAFLD发病机制尚未明确，但学者普遍认为脂代谢紊乱(肥胖)和胰岛素抵抗为疾病的初次打击，可导致肝脏发生脂肪变性，并降低肝细胞活力，使得肝脏发生氧化应激损伤及炎症损伤，进而产生二次打击，最终导致坏死，甚至肝纤维化[11，12]。双环醇可显著提高线粒体膜流动性，改善线粒体腺嘌呤核苷三磷酸酶活性，从而缓解肝脏能量代谢紊乱，避免肝脏氧化应激损伤，并抑制细胞核内核因子κB结合活性，进一步降低炎症因子的释放[13]。研究[14]显示非诺贝特可通过上调胰腺胰岛素合成转录因子基因表达，促进胰岛素的生物合成，降低机体胰岛素抵抗，从而减少肝脏脂质累积，避免初次打击，从而减少肝细胞脂肪变性损伤导致的炎症级联反应，降低多种炎症因子血清水平，控制NAFLD患者肝脏慢性炎症反应进程。因此，本研究观察组血清TNF-α、IL-6和hs-CRP水平显著低于对照组。免疫功能异常被认为是导致NASH患者肝纤维化和炎症的基础，研究[15]显示肝脏局部微环境中高水平的脂肪酸可降低组织CD4+细胞聚集。本研究在治疗后，观察组外周血CD3、CD4细胞和CD4/ CD8细胞比值显著高于对照组，说明治疗后观察组免疫功能得到了明显的改善。分析其原因可能为双环醇降低了肝脏损伤，观察组联用非诺贝特，效果更好。研究[16]显示非诺贝特一方面可改善血脂代谢，避免高水平脂肪酸对机体免疫功能的抑制作用；另一方面，非诺贝特可抑制炎性细胞因子、趋化因子和促纤维化基因的表达，减少肝星状细胞的活化，抑制肝纤维化的发生[17]，避免了免疫细胞的耗竭，帮助机体免疫功能的恢复。

既往研究[18]显示，非诺贝特为PPAR-α的配体，动物实验证实其可通过激活PPAR-α信号通路，抑制机体炎症反应及肝纤维化进程，但临床实验中尚无确切的证据表明PPAR-α激动剂能改善NAFLD病情。PPARs属于细胞核激素受体超家族，PPAR-α和PPARγ2均为其亚型之一，PPARγ2主要在机体脂肪组织中表达，是调节三酰甘油稳态的主要角色，也可调控脂肪细胞增殖，还可调节机体炎症反应，抑制氧化应激损伤[19]。本研究对NAFLD患者肝组织PPARγ2mRNA进行了研究，发现治疗后，观察组肝组织PPARγ2mRNA水平显著高于对照组，说明非诺贝特可能通过提高肝组织PPARγ2表达，促进脂肪重新分布，使脂肪从肝脏等内脏组织转移并消耗，进而抑制肝细胞脂肪变性，减轻肝脏巨噬细胞浸润，而非诺贝特影响PPARγ2表达的具体机制则有待进一步研究。在双环醇基础上应用非诺贝特可进一步调节机体血脂代谢紊乱，减轻肝细胞损伤，进而促进肝功能恢复。因此，以症状、体征、肝功能以及血脂各项指标的改善作为疗效判断的标准，发现观察组总有效率显著高于对照组。