MiR-1207-3p靶向XRCC6对结直肠癌细胞HT-29凋亡的影响研究

朱利芹 冯莹 曹惠芳 杜楠

(1.上海市静安区中心医院呼吸内科，上海 200040；2.淮安市第一人民医院肿瘤内科，江苏 淮安 223300)

结直肠癌属于临床常见的胃肠道恶性肿瘤，早期临床表现不典型，伴随肿瘤组织不断增大而出现排便习惯改变、腹泻、便血、便秘等临床症状，在疾病晚期病患可出现贫血以及体质量下降等全身性临床症状，对病患生命安全产生严重威胁[1]。有报道[2]指出，miRNA异常表达在肿瘤发生与发展中具有重要意义，其中miRNA具备抑癌基因或者癌基因的能力，受到临床重点关注。MicroRNA(miRNAs微小PaqA)是一种单链非编码RNA分子，广泛存在于人类、动物、植物的细胞中，其长度约19～24 nt，通过与靶基因序列特异性相互作用在转录水平调节基因表达，肿瘤的发生、进展有关，作为一类新型基因调节剂与结直肠癌的关系相当密切[3]。X射线修复交叉补充因子6(XRCC6)抑制吉西他滨诱导的DNA损伤和多种癌细胞凋亡，参与DNA双链断裂修复和重组[4]。MiR-1207-3p通过纤维连接蛋白调节前列腺癌中的雄激素受体，但miR-1207-3p在结直肠癌中的作用未见报道。本研究探讨miR-1207-3p靶向XRCC6对结直肠癌细胞HT-29凋亡的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料 上海康朗生物科技有限公司提供的miRNA cDNA第一链合成试剂盒；哈尔滨海基生物科技有限公司提供的miR-1207-3p SYBRGreen miRNA实时荧光定量PCR试剂盒；生工生物工程(上海)股份有限公司提供的miR-1207-3p mimics和miR-1207-3p inhibitor；齐一生物科技(上海)有限公司提供的Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒；汉恒生物科技(上海)有限公司提供的LipoFiter3转染试剂；Sigma公司提供的蛋白裂解液；北京索莱宝科技有限公司提供的青链霉素混合液；北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供的2×SDS蛋白电泳上样缓冲液；美国Bimake公司提供的蛋白酶抑制剂Cocktail；美国Hyclone公司提供的RPMI-1640培养基；英国Abcam公司提供的XRCC6，Cleaved-Casp3，Cleaved-Casp9，TUBULIN抗体；美国Gbico公司提供的胎牛血清；中科院上海生命科研所提供的HT-29细胞；生工生物工程(上海)股份有限公司提供的PBS。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 结直肠癌细胞HT-29维持在含有100 μg/mL链霉素、10%热灭活的胎牛血清以及100 U/mL青霉素的RPMI-1640培养基中，培养环境为潮湿37℃、5%CO2培养箱。对结直肠癌细胞HT-29进行LipoFiter3转染试剂转染，将脂质体与miR-1207-3p mimics或inhibitor相混合20 min后，滴入HT-29细胞。

1.2.2Western blot 进行10%SDS-PAGE的电泳，转移到PVDF膜上，随后将PVDF膜进行封闭1 h，封闭环境为0.01%Tween-20和5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水。然后在4℃下与目的蛋白的抗体温育过夜，使用ECL Plus Western印迹检测系统对特定蛋白质进行观察，将PVDF膜在室温下与缀合有HRP的相应二抗孵育1 h。

1.2.3qRT-PCR 用细胞刮将结直肠癌细胞HT-29刮入EP管中，用PBS洗3次，对MCF7的miRNA进行miRNA快速提取，将纯化好的总miRNA进行逆转录。用miR-1207-3p的正向和反向引物进行qRT-PCR。MiR-1207-3p上游引物序列为5′-TCAGCTGGCCCTCATTTC-3′，内参U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-GAAATGAGGGCCAGCTGA-3′，内参U6下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。1 μL 10×miScript通用引物溶液，1μL 10×miScript配对引物溶液，最后用9.5 μL DEPC水补足25 μL混合液。将7500Real-Time PCR仪(Biosystems)设置扩增条件：95℃×10 min，然后将95℃×15 s、56℃×30 s，72℃×35 s过程进行40个循环，最终将产物放置于-20℃保存。所有实验重复3遍。

1.2.4Annexin V染色 将结直肠癌细胞HT-29置于37℃5%CO2和1%O2的缺氧室中静置16～18 h，随后在低氧或含氧量正常的条件下培养结直肠癌细胞HT-29 2 h，在指定的氧条件下用1 μm阿糖胞苷处理16～18 h，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，使用Annexin V-FITC-A进行染色。

2 结 果

2.1MiR-1207-3p与XRCC6的相关性 采用TargetScan生物软件分析后，发现miR-1207-3p处于16～22的位置与XRCC6的3′端非编码区有1处高度匹配，见图1。将 XRCC6的3′端非编码区做 UC 非匹配突变，并选取一种野生型的XRCC6作为对照，通过luciferase assay，MT-XRCC6 3′UTR报告活性降低(t=14.730，P<0.001)。见图2。

图1 TargetScan生物软件在线分析miR-1207-3p与XRCC6相关性

图2 利用双荧光素酶报告系统检测miR-1207-3p靶向XRCC6基因

2.2过表达miR-1207-3p后XRCC6蛋白和HT-29细胞凋亡标志蛋白的表达量 为进一步证实miR-1207-3p靶向XRCC6与HT-29细胞凋亡的相关性，对miR-1207-3p的相对表达量进行qRT-PCR检测，结果发现在转染miR-1207-3p mimics进HT-29细胞后，其相对表达量显著增加(t=17.730，P<0.001)；XRCC6 的表达量采用Western Blot 检测，结果发现细胞凋亡标志蛋白 Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表达量上升，XRCC6 的表达量下降，HT-29 细胞凋亡水平上升(t=34.180，P<0.001)。见图3～图5。

图3 转染miR-1207-3p mimcs后miR-1207-3p的表达水平

图4 过表达miR-1207-3p时XRCC6和凋亡相关蛋白表达水平

图5 过表达 miR-1207-3p 时 HT-29 细胞凋亡水平

3 讨 论

结直肠癌作为临床常见的恶性肿瘤，主要发生在患者肠黏膜上皮细胞，受到遗传或者环境因素影响后产生恶性变化，不仅具有较高的患病率及复发率，同时癌细胞出现转移的风险较大，不仅对患者消化系统造成一定伤害，同时可能牵连患者肺脏、骨骼、淋巴与肝脏受损，直接危及生命安全[5]。

miRNA属于微小RNA分子，可在细胞内发挥多种调节作用。由于miRNA具有较高的特异性、保守性以及稳定性等特点，因此在研究疾病发生、发展以及预后方面具有积极意义[6]。在人体内，它通过与靶基因mRNA分子3′端非编码区结合，抑制靶基因的翻译，负调控靶基因的蛋白水平[7]。研究[8]表明它在胚胎发育、细胞分化、血管形成、肿瘤发生等许多重要病理生理过程中发挥调控作用。在肿瘤方面，研究[9]发现miRNA与肿瘤的发生、转移微环境形成、浸润甚至治疗耐受等有密切关系。近年来，研究[10]表明miRNA与肿瘤发生关系密切，由于相关的靶基因对肿瘤的作用不同，不同miRNA在肿瘤中表达情况也存在差异，因而可以根据这种表达差异来判断miRNA对肿瘤的调控作用。

本研究通过TargetScan分析，发现MiR-1207-3p由位于8q24易感基因位点的PVT1非蛋白编码基因编码，能够靶向结合XRCC6的3′端非编码区的16～22的区域。研究还发现，结直肠癌细胞 HT-29 凋亡水平与miR-1207-3p相关，miR-1207-3p过表达，HT-29凋亡水平上升，细胞凋亡标志蛋白CleavedCasp3、Cleaved-Casp9的表达量显著上升，XRCC6的表达量下降，分析原因：miR-1207-3p所致的XRCC6表达量下降导致游离Bax的增多，造成XRCC6-Bax复合体的减少，导致Bax进入线粒体引发了细胞凋亡，XRCC6 通过C-末端接头结构域中赖氨酸残基的乙酰化进行转录后调节，导致Bax的释放，XRCC6的乙酰化受组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶的调节，两组相反的酶主要参与染色质重塑。

综上所述，miR-1207-3p可通过抑制XRCC6表达量来促进结直肠癌细胞HT-29的凋亡。