三种品牌牛奶的荧光光谱特性研究

殷文志，王婷钰，朱 拓，马超群，辜 姣，朱 纯，李 磊，陈国庆*

1.江南大学理学院，江苏 无锡 214122 2.江南大学物联网工程学院，江苏 无锡 214122 3.江苏省轻工光电工程技术研究中心，江苏 无锡 214122

引 言

牛奶中富含蛋白质、脂肪、维生素和无机盐等多种人体需要的营养物质，其中蛋白质是最重要的营养成分之一，牛奶中的蛋白质可以为人体提供20多种氨基酸，其中有8种是人体不能合成的必需氨基酸，且消化率达到90%～100%[1-2]。目前，市场上牛奶的种类很多，质量参差不齐，一些不法商贩在牛奶中添加非法添加物或者掺假物，比如2008年的三聚氰胺事件和2011年的黄曲霉毒素M1超标事件[3]。诸多乳品安全事件的发生，快速准确的检测牛奶已势在必行[4-5]。

目前，国内外牛奶检测领域存在多种方法，比如：酶联免疫吸附法(ELISA)[6]和胶体金免疫层析法(CGIA)[7]是利用免疫学检测技术对牛奶进行检测，具有较高的灵敏度和特异性，但也存在预处理步骤较为繁琐和成本较高的问题；高效液相色谱法(HPLC)[8]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[9]和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[10]等仪器分析方法具有灵敏度高和精度高的优点，比较适合低浓度目标的检测，但仍存在预处理步骤较多和易受干扰的不足；近红外光谱法(NIR)[11]和拉曼光谱法(RS)[12]是使用光谱方法对目标进行分析检测，具有检测时间短和对目标分子破坏较小等优点，然而近红外光谱的灵敏度较低，拉曼光谱的强度较弱，限制了其应用范围。

荧光光谱技术(FS)可以反映目标分子的特性，可对目标分子定性或定量检测。荧光光谱法具有选择性好、灵敏度高、操作简单和用样量少等优点，被应用于诸多复杂混合物体系的精确检测。

本文采用荧光光谱技术，对市场上的三种品牌的不同脂肪含量的纯牛奶(超高温灭菌奶)、鲜奶(巴氏杀菌奶)在不进行预处理的情况下进行测试，研究牛奶的荧光光谱，推断牛奶的主要荧光物质，并分析全脂牛奶和脱脂牛奶荧光光谱的异同及其原因，为牛奶的成分鉴别和混合物的光谱检测提供一定的帮助。

1 实验部分

1.1 仪器

实验采用英国Edinburg生产的FLS920P型稳态和时间分辨荧光光谱仪。

1.2 样品

实验所用三个品牌牛奶分别记为A，B和C，牛奶的种类包括：全脂纯牛奶、脱脂纯牛奶、全脂鲜奶和脱脂鲜奶，共9种。实验所用酪蛋白(干酪素)为国药集团化学试剂有限公司提供。

1.3 方法

测量9种牛奶样品和酪蛋白溶液的三维荧光光谱，每次取350 μL牛奶样品移入石英微量比色皿中，激发波长范围为250～450 nm，发射波长范围为265～550 nm，激发波长步长为5 nm，发射波长步长为1 nm，激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm，积分时间为0.1 s。

测量9种牛奶样品和酪蛋白溶液的时间分辨荧光光谱，以波长为273.7 nm脉冲光源激发，探测波长为349 nm。

将全脂纯牛奶C以12 000 r·min-1的速度离心15 min，去除上层脂肪后，将下层样品震荡5 min，得到离心后的牛奶样品，测量其荧光发射光谱。

使用超纯水分别将9种牛奶稀释至0.1%浓度，测量得到光透过率曲线。

2 结果与讨论

实验测得9种牛奶样品的三维荧光光谱，以品牌C为例，图1(a)和图1(b)分别为全脂纯牛奶C和脱脂纯牛奶C的三维荧光光谱，可以看出牛奶在紫外光激发下产生较强的荧光，二者的荧光光谱除荧光强度外基本一致。表1为9种牛奶的荧光光谱特征参数，峰值波长为349 nm左右，最大相差5 nm，半高宽为66 nm左右，最佳激发波长为291 nm左右，最大相差4 nm，表明9种牛奶的主要荧光物质是相同的。

表1 牛奶的荧光光谱特征参数Table 1 Fluorescence spectral characteristic parameters of milk

图1 牛奶的三维荧光光谱(a)：全脂纯牛奶C；(b)：脱脂纯牛奶CFig.1 Three-dimensional fluorescence spectra of milk(a)：Whole milk C；(b)：Skim milk C

牛奶主要由蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素等组成，实验表明脂肪(在牛奶中主要以脂肪球的形式存在)和碳水化合物没有荧光，维生素中的维生素B2和维生素B6的荧光峰值波长和最佳激发波长分别为535和440 nm，395和325 nm。当激发波长为291 nm时，两种维生素的荧光较弱。牛奶中酪蛋白占蛋白质的80%左右，在300～400 nm范围有较强的荧光。

实验得到酪蛋白的荧光光谱，酪蛋白的荧光峰值波长为344 nm，半高宽为66 nm，最佳激发波长为295 nm。激发波长为291 nm时酪蛋白溶液和9种牛奶的荧光发射光谱如图2。

从图2看出，酪蛋白与牛奶的荧光光谱除荧光强度外基本一致，且谱形相似。推断牛奶在291 nm激发波长下产生荧光的主要荧光物质是酪蛋白。

图2 酪蛋白溶液和9种牛奶的荧光发射光谱(激发波长为291 nm)Fig.2 Fluorescence emission spectra of casein solution and 9 kinds of milk (excitation wavelength is 291 nm)

为验证这一推断，测得9种牛奶和酪蛋白溶液的时间分辨荧光光谱，如图3所示，9种牛奶的时间分辨荧光光谱无明显的差别，平均荧光寿命都为4.6 ns左右，酪蛋白的平均荧光寿命为4.1 ns，荧光寿命拟合参数如表2所示。

图3 9种牛奶和酪蛋白溶液的时间分辨荧光光谱Fig.3 Time resolved fluorescence spectra of 9 kinds of milk and casein solution

表2 9种牛奶和酪蛋白溶液的荧光寿命拟合参数Table 2 Fitting parameters of fluorescence lifetime of 9 kinds of milk and casein solution with excited

从时间分辨荧光光谱可以看出牛奶与酪蛋白的荧光寿命基本一致，牛奶的主要荧光物质为酪蛋白，而牛奶的荧光寿命稍大于酪蛋白，这可能是牛奶中其他物质的影响，造成牛奶与酪蛋白的荧光寿命有较小差异。

酪蛋白是由多种氨基酸以肽键组成的高分子化合物，其中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是荧光物质。图4为色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的分子结构，这些氨基酸的苯环含有共轭双键，分子被激发后，会发生π→π*跃迁，此时分子处于激发态，但激发态的分子不稳定，会通过S1→S0的辐射跃迁发射荧光。实验表明色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的荧光峰值波长和最佳激发波长分别为350和290 nm，300和270 nm，282和258 nm，且它们的相对荧光强度为100∶9∶0.5，所以酪蛋白在激发波长为291 nm时产生的荧光更多的是来自色氨酸[13]。

图4 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的分子结构Fig.4 Molecular structure of tryptophan， tyrosine and phenylalanine

图2中9种牛奶样品在激发波长为291 nm时的荧光发射光谱，相同品牌的脱脂牛奶荧光强度高于全脂牛奶。全脂牛奶和脱脂牛奶的区别主要是脂肪含量，脂肪的存在对牛奶荧光强度有一定的影响。

为了探究脂肪含量对荧光强度的影响，对全脂纯牛奶C进行了离心处理，去除脂肪，图5是激发波长为291 nm时全脂纯牛奶C、脱脂纯牛奶C和离心后的全脂纯牛奶C归一化后的荧光发射光谱。

图5 全脂纯牛奶C、脱脂纯牛奶C和离心后的全脂纯牛奶C归一化后的荧光发射光谱(激发波长为291 nm)Fig.5 The normalized fluorescence emission spectra of whole milk C，skim milk and whole milk C after centrifugation (excitation wavelength is 291 nm)

图5中离心后的全脂牛奶荧光强度介于全脂和脱脂之间，脂肪的减少使得牛奶的荧光强度有所增加，而离心处理的牛奶脂肪含量高于脱脂牛奶也使得其荧光强度低于脱脂牛奶。

测得291 nm激发下全脂纯牛奶C和脱脂纯牛奶C的荧光发射全谱，如图6，可以看出全脂牛奶的瑞利散射强度明显高于脱脂牛奶。全脂牛奶的脂肪含量高，散射强，激发光入射全脂牛奶后更多地被散射，使得其荧光强度低于脱脂牛奶。

图6 全脂纯牛奶C和脱脂纯牛奶C的荧光发射全谱(激发波长为291 nm)Fig.6 Full fluorescence emission spectrum of whole milk C and skimmed milk C (excitation wavelength is 291 nm)

图7为9种牛奶稀释后的光透过率曲线，全脂牛奶的透过率都低于脱脂牛奶。入射光通过全脂牛奶时，除了一部分被酪蛋白吸收以外，还有一部分因脂肪的散射而损失，透过率减小，使得全脂牛奶的透过率都低于脱脂牛奶。

图7 9种牛奶的光透过率曲线Fig.7 The light transmittance curve of 9 kinds of milk

实验研究表明脂肪的存在会导致散射增加，使得全脂牛奶的荧光强度低于同品牌的脱脂牛奶。

3 结 论

9种牛奶的三维荧光光谱和时间分辨荧光光谱显示，牛奶可以在紫外光的激发下产生荧光，荧光峰值波长为349 nm左右，半高宽为66 nm左右，最佳激发波长为291 nm左右，平均荧光寿命为4.6 ns左右。实验表明9种牛奶荧光光谱除荧光强度外基本一致，牛奶的主要荧光物质相同，并通过对比实验推断牛奶的主要荧光物质是酪蛋白。全脂牛奶的荧光强度低于同品牌的脱脂牛奶，是由于脂肪的存在会使得散射变强。研究工作可对人们健康饮用不同类型的牛奶有所指导，也可为牛奶这种复杂混合物的分析检测提供帮助。