基于硒化锌薄膜法的食源性致病菌原位红外光谱检测

刘艳艳，陶宁萍,2,3，王锡昌,2,3，卢 瑛,2,3*，许长华,2,3*

1.上海海洋大学食品学院，上海 201306 2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306 3.国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海)，上海 201306

引 言

食源性致病菌可以直接或间接地污染食品和水源，导致人类肠道传染病或禽畜传染病的流行，是引起食品安全问题的重要来源。美国疾病控制中心报道显示，美国平均每年约有3 000人死于食源性致病菌所引发的疾病[1]。近年来，我国由微生物感染引起的疾患发病率高达61.92%，其中主要是大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌等[2]。目前，食源性致病菌常用的检测方法包括传统生化方法、分子生物学方法、免疫学方法、生物传感器技术等方法[3]。但这些方法往往步骤繁琐、耗时耗力、有的需要专业人员，仪器试剂费用高，难以在常规实验室广泛应用。相反，红外光谱技术可以反映整个细胞组分的整体信息，相比其他方法更加快速、无损、成本低且灵敏度高，受到众多研究者的关注[4]。

溴化钾压片法是比较传统且至今最为常用的固体制样方法，其在致病菌的红外检测中已有大量报道。杨丽君等[5]以大肠杆菌为例，探讨了不同的细菌浓度和培养时间以及是否加热灭活等不同的前处理方式对光谱特征的影响。结果表明，统一的样品前处理是决定检测是否成功的关键。硒化锌薄膜法是利用硒化锌窗片作为载体，将菌液进行简单预处理后滴加至硒化锌窗片中央，低温烘干后可直接进行红外检测的一种前处理方法。王静[6]等利用硒化锌薄膜法对两株不同来源的大肠杆菌进行红外检测，并对所采集的光谱进行主成分分析和层次聚类分析。结果表明红外光谱结合化学计量学可以区分不同来源的同种细菌，但该研究并未对硒化锌薄膜法和常规溴化钾压片法进行比较分析，硒化锌薄膜法的准确性与优势并未得到揭示。以上研究均说明样品前处理是保证红外检测质量的关键，因此，寻找一种更加快速、合适的前处理方式仍为目前研究的热点。本研究分别采用硒化锌薄膜法和常规溴化钾压片法，对四种食源性致病菌(大肠杆菌DH5α、沙门氏菌CMCC 50041、霍乱弧菌SH04、金黄色葡萄球菌SH10)进行原位红外光谱整体检测，并对所得图谱进行详细对比分析，为更加快速精确的致病菌检测提供技术支持。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

0.9%生理盐水(NaCl：分析纯；国药集团化学试剂有限公司)、超纯水(18.2 MΩ·cm)、溴化钾(光谱纯；自贡三川实业有限公司)、硒化锌窗片(直径12 mm，厚度1 mm；天津博天胜达科技发展有限公司)、TG16-WS型离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、TDZ5-WS小型台式离心机(上海年悦仪器有限公司)、DW-86L626立式超低温保存箱(-80 ℃；青岛海尔特种电器有限公司)、GHP-9270隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、ZQZY-70B振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)、WH-2型涡旋混合仪(成都一科仪器设备有限公司)、FD-80型真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)、DHG-9140A型鼓风干燥箱(上海慧泰仪器制造有限公司)、DF-4型压片机(天津市港东科技发展有限公司)、红外光谱(FT-IR)仪(英国PerkinElmer公司，配置DTGS检测器)。

1.2 菌种与培养基

大肠杆菌DH5α (EscherichiacoliDH5α,E.coliDH5α)、沙门氏菌CMCC 50041 (SalmonellaenteritidisCMCC 50041,S.enteritidisCMCC 50041)、霍乱弧菌SH04 (VibriocholeraeSH04,V.choleraeSH04)、金黄色葡萄球菌SH10 (StaphylococcusaureusSH10,S.aureusSH10)。以上菌种均来自上海海洋大学食品学院微生物重点实验室；菌株用25%甘油保存于-80 ℃冰箱中备用；LB琼脂培养基(北京陆桥生物技术有限公司)；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB，北京奥博星生物技术有限责任公司)。

1.3 样品的制备及光谱采集

将保存于-80 ℃冰箱的菌株取出，用无菌接种环挑取一环划线至LB固体培养基，并于37 ℃恒温培养箱中培养16 h，挑取单菌落至盛有10 mL TSB的培养基，并于37 ℃恒温震荡培养箱中培养5 h左右，使其处于对数期，浓度约为108～109CFU·mL-1；分别取5和1 mL菌液于10和2 mL的离心管，8 000 r·min-1，20 ℃，离心4 min并除去上清液，用0.9%生理盐水清洗一次，超纯水清洗两次(离心条件同上)，其中5 mL菌液除上清后置于真空冷冻干燥机中冻干2 d备用，另一份1 mL菌液去上清，重悬于100 μL的超纯水中备用[7]。

取1～1.5 mg冻干的菌体粉末与约100 mg溴化钾晶体充分混合研磨，将研磨好的粉末倒入压片模具中，施加压力(约8 t 左右)，1 min后卸载压力，即可得到半透明样品薄片，对薄片进行光谱采集[8]；另吸取10 μL菌液于硒化锌窗片中央，并置于48 ℃干燥箱，烘干40 min左右，至呈现干燥菌斑，取出后置于红外光谱仪样品舱内进行光谱采集。分辨率4 cm-1；扫描范围4 000～600 cm-1；扫描次数：32次；扫描过程中扣除CO2和H2O的干扰。

1.4 数据预处理

为降低噪音并提高图谱“表观分辨率”，利用Spectrum 10TM(PerkinElmer)对所采集的光谱进行基线校正、平滑、归一化等处理，并利用二阶13点SavitskyGolay算法计算二阶导数图，每个样品做六个平行，求平均光谱，并在不同时间段重复测试三次[9-11]。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理对比分析

硒化锌薄膜法与溴化钾压片法的前处理流程图(图1)显示：两种方法均需要对菌株进行活化纯培养及离心去除培养基等处理。此外，硒化锌薄膜法仅需要对菌体沉淀进行重悬(1 min)、低温烘干(48 ℃)即可进行红外检测，共计耗时约50 min。而溴化钾压片法则需要对备用菌株进行低温预冻(>5 h)、冻干(2 d左右)以及压片处理才可进行检测，共计耗时约54 h。结果表明，与溴化钾压片法相比硒化锌薄膜法不仅可以简化前处理流程，大大节省时间，且所需样品量少(10 μL)，对样品不须进行研磨等物理破坏，保持了样品的完整性，有益于检测结果的准确性。

图1 硒化锌薄膜法与溴化钾压片法(含前处理)流程图Fig.1 Diagram (including sample pretreatment) of ZnSe film transmission and KBr pressed pellet method

2.2 整体红外宏观指纹图谱对比分析

图2 基于硒化锌薄膜法的四种食源性致病菌整体红外宏观指纹图谱Fig.2 Integrated infrared macroscopic fingerprint of four foodborne pathogens based on ZnSe film transmission method

表1 四种食源性致病菌的红外特征谱带指认Table 1 Major spectral band assignments for Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) of four foodborne pathogens

图3 基于硒化锌薄膜法与溴化钾压片法的四种食源性致病菌整体红外宏观指纹对比图(a):大肠杆菌DH5α;(b):沙门氏菌CMCC 50041;(c):霍乱弧菌SH04;(d):金黄色葡萄球菌SH10Fig.3 Comparison of IR spectra in four foodborne pathogens based on ZnSe film transmission and KBr pressed pellet method(a)：E.coli DH5α；(b)：S.enteritidis CMCC 50041；(c)：V.cholerae SH04；(d)：S.aureus SH10

四种食源性致病菌利用硒化锌薄膜法与溴化钾压片法的全波段(4 000～600 cm-1)红外谱图(图3)基本一致，特征峰的位置、强度以及峰形总体没有明显差异。然而，硒化锌薄膜法的特征峰在4 000～2 500 cm-1更为尖锐，较溴化钾压片法更为明显。

2.3 二阶导数整体红外宏观指纹图谱

图4 大肠杆菌DH5α二阶导数整体红外宏观指纹图谱Fig.4 SD-IR spectra of E.coli DH5α in the region of 4 000～600 cm-1

图5 基于硒化锌薄膜法与溴化钾压片法的四种食源性致病菌二阶导数红外宏观指纹对比图(1 500～900 cm-1)(a)：大肠杆菌DH5α；(b)：沙门氏菌CMCC 50041；(c)：霍乱弧菌SH04；(d)：金黄色葡萄球菌SH10Fig.5 Comparison of SD-IR comparison spectra in four foodborne pathogens based on ZnSe film transmission and KBr pressed pellet method (1 500～900 cm-1)(a)：E.coli DH5α；(b)：S.enteritidis CMCC 50041；(c)：V.cholerae SH04；(d)：S.aureus SH10

表2 硒化锌薄膜法与溴化钾压片法二阶导数图谱(1 500～900 cm-1)特征峰比较Table 2 Comparison of characteristic peak in SD-IR spectra (1 500～900 cm-1) based on ZnSe film transmission and KBr pressed pellet method

3 结 论

四种食源性致病菌的硒化锌薄膜法与溴化钾压片法对比分析表明：薄膜法的综合效果更好。其中，在前处理流程中，硒化锌薄膜法不仅大幅度简化操作步骤，缩短处理时间(共计50 min以内)，且不需冻干与研磨，极大降低对样品的破坏程度以及外界引入的干扰。此外，两种方法所测得的红外原始图谱及二阶导数图谱的详细比对分析表明：硒化锌薄膜法所测得的图谱信噪比较好且分辨率高，信息丰富稳定。因此，基于硒化锌薄膜法的食源性致病菌原位红外光谱整体检测技术对于快速、无损的致病菌红外检测具有重要的应用价值。