基于氨基酸的古代食谱重建

马 颖，董瑞瑞，Benjamin T.Fuller，魏书亚

1.北京科技大学，北京 100083 2.Department of Archaeology and Heritage Studies,School of Culture and Society,Aarhus University, Moesgård Allé 20,DK-8270,Højbjerg,Denmark

引 言

近年来，考古遗址出土的人和动物骨骼逐渐得到了越来越多考古学家的重视。除了传统体质人类学、形态学等工作的开展，更多自然学科，包括古DNA、古蛋白学、地球化学等方法的介入，极大的丰富了考古学相关研究。这其中，针对人和动物骨骼提取的骨胶原进行的稳定同位素分析是重建古代先民食谱，古营养以及古环境的重要手段[1]。

在考古学中，一般以人骨胶原的δ15N值高于同一个考古学地点的草食性动物骨胶原的δ15N值的程度，来估算人类营养位置或动物蛋白在人类饮食中的比例[2]。这些基于骨胶原的稳定同位素分析，整合了样品中所有含氮实体，尽管可以提供很多信息，但也存在一定的问题。这些大分子的δ15N值常受到多种因素的影响。例如，当研究个体受到疾病、创伤、生长过快、饥饿、怀孕等各种生理压力的影响时，其氮的代谢会出现异常，因此会导致我们做出错误的判断[3]。

在一些特殊的环境下，如干旱地区，动植物的δ15N含量异常丰富，这就使得基于氮同位素的营养位置解释变得模棱两可[4]。同时，农作物的施肥也会对动植物的δ15N值产生极大影响[5]。这种对农作物δ15N值的影响会导致食用施肥作物的人的骨胶原δ15N值远高于食用未经施肥农作物的草食动物的骨胶原δ15N值，从而导致对饮食中动物蛋白摄入的高估。

鉴于此，对考古学而言，目前急需一种更有力的手段精细对古代食谱的研究。而基于单分子氨基酸的同位素分析技术可在分子水平上对胶原蛋白进行分析，并能克服大分子同位素固有的不确定性，对古代先民营养级位置进行准确评估，展现了极大的潜力可用于古代食谱的重建研究。

本研究对考古遗址出土的人和动物骨骼开展基于单分子氨基酸氮同位素分析的尝试性研究，以期能获取古代先民精确的营养级信息，了解古代先民食物结构差异，从而为进一步讨论人类等级分化，社会阶层出现等考古学问题提供新的见解。

1 实验部分

1.1 样品及考古遗址背景

选取突尼斯迦太基城凡达里奇墓地出土的人和动物骨骼，共计14例样品，其中人骨骨骼10具，动物样品4具，详细取样信息见表1。该遗址位于北非突尼斯迦太基城北城墙外向西200 m处，根据墓葬出土陶器和钱币特征，推测该墓地的使用年代在5世纪中期至6世纪早期，为迦太基汪达尔时期的墓葬群[6]。

表1 突尼斯迦太基城凡达里奇墓地出土人和动物样品信息Table 1 Sampling information of human and faunal skeletons excavated from Vandalic cemetery in Carthage,Tunisia

样品的年龄估计和性别判定由体质人类学的标准方法确定[7]。实验选择肋骨和长骨碎片进行胶原蛋白提取和同位素分析。动物遗骸，包括牛，猪，羊等种属，用作同位素基线，便于与人类结果进行比较。

1.2 样品处理

每个个体称取300～500 mg骨样，喷砂枪去除骨样表面污染后，5 ℃下置于0.5 mol·L-1HCl溶液浸泡，每隔2～3 d换新鲜酸液，直至骨样松软、无明显气泡为止。再用去离子水洗至中性，在0.01 mol·L-1的HCl溶液下70 ℃明胶化48 h，热滤，经过Millipore Amicon Ultra filter超滤后收集分子量>30 K的溶液，冷冻干燥，收集明胶化的骨胶原。最后称重，计算胶原蛋白提取率。

骨胶原水解根据文献中描述的方法进行改进[8]。称取约1.0 mg胶原蛋白并加入0.5 mL 6N HCl，110 ℃加热20 h，将胶原蛋白水解成单个氨基酸。水解后，将溶液在60 ℃氮气下吹干，加入200 μL 0.1 N HCl，-60 ℃下保存。我们在Corr等提出的N-乙酰基异丙基酯(NAIP)衍生化方法上进行了较小的修改[9]。用1.8 mL乙酸乙酯将样品提取到GC样品瓶中，并在冰箱(4 ℃)中放置过夜。室温下吹干后，将NAIP重新溶解在二氯甲烷中并调节至所需体积。每个样品中加入正亮氨酸(500 μL，0.2 mg·mL-1)作为内标。

1.3 方法

样品骨胶原C和N元素含量及稳定同位素的测试仪器为Flash EA 2112元素分析仪串联Thermo-Finnigan Delta XP稳定同位素质谱仪。

单分子氨基酸氮同位素比值在通过GC Combustion Ⅲ接口与Delta V Plus同位素比质谱仪(Thermo Scientific)(GC-C-IRMS)连接的Agilent 6890N气相色谱仪上进行[10]。

测样采用序列样品，由一个标准样品，两个质量控制样品和四至五个样品组成。每个样品的报告值是一式三份测定的平均δ15N值。与这些三次重复分析相关的平均误差为0.6σ。衍生氨基酸标准品的平均误差为±0.9‰。

2 结果与讨论

所有样品的骨胶原蛋白提取率均>1%，原子C∶N在2.9～3.6之间，保存质量良好。样品骨胶原稳定碳、氮同位素与单分子氨基酸氮同位素分析结果详见表2。对样品骨胶原δ13C和δ15N绘制散点图，如图1所示。

图1 狄奥多西墓地出土人和动物样品骨胶原碳、氮同位素值散点图Fig.1 Bulk collagen δ13C and δ15N results from the Carthage Vandalic cemetery,Tunisia

表2 骨胶原稳定同位素及单分子氨基酸同位素测试结果Table 2 Bulk isotopic information and amino acids nitrogen isotopic results of human and faunal samples

四个陆生动物的δ13C值在-20.7‰～-21.9‰之间，δ15N值在6.1‰～8.3‰，相差不大。牛和羊的δ15N值较为接近，体现了较为明显的食草类动物特性。猪的δ15N值较牛和羊高近2‰，猪是杂食性动物，其可能摄入了一定量动物蛋白而导致其氮同位素值有所富集。10个人的δ13C值均值为-19.6‰±0.5‰，分布在-18.8‰～-20.9‰之间，这说明该遗址居民主要以C3类食物为主。人的δ15N值平均值为11.1‰±1.3‰，较高的δ15N值表明该遗址先民饮食摄入有大量的动物蛋白。δ15N值在8.7‰～13‰之间，表明不同个体存在较大差异，最高的个体与最低的个体δ15N值相差3.3‰，显示先民在肉食资源的获取方式上显著不同。个体Aus01具有明显最高δ15N值13‰,有可能摄取了一定比例的水生/海洋蛋白，但也无法排除是否由其他高N背景值的地区迁徙而来的可能。

在骨胶原的20种氨基酸中，我们获得了4种必要氨基酸(苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和赖氨酸)(Phe，Val，Leu，Lys)和7种非必要氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸，羟脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)(Ala，Gly，Ser，Pro，Hyp，Asx，Glx)。图2所示具有代表性的样品(Aus105：羊)的色谱保留时间图。所有氨基酸均通过气相色谱进行基线分离，由于本研究主要考察两种氨基酸(苯丙氨酸和谷氨酸)的氮同位素值，所以仅在此报道δ15Nphe和δ15NGlu值。

图2 代表性(Aus105：羊)样品的色谱分离及保留时间图Fig.2 Representative GC-C-IRMS chromatogram showing the individual bone collagen amino acids separated and retention times (Sample:Aus 105，sheep)TPAA=((δ15NGlu-δ15NPhe+8.4)/7.6)+1[13]

人和动物的δ15Nphe在9.4‰～10.7‰之间，平均值为10.5‰±0.7‰，并不存在明显不同。这表明，人和陆生动物的食物源相似，因为苯丙氨酸的δ15N值在食物和消费者间的富集非常小，仅0.4‰。而δ15NGlu值差异显著，在8.8‰～16.7‰间，均值为14‰±2.5‰。根据实验室饲喂实验和田间生态研究的结果，δ15NGlu值随着营养级升高而递增[11]。在陆地生态系统中，C3类植物和C4类植物Δ15NGlu-Phe值具有显著差异，一般C3类植物在-8.4‰左右，而C4类植物在0.4‰左右。不同生态系统中有机体的营养级位置可基于特定的方程而进行量化[12]。其中，陆地C3类生态系统的计算方程式可表达为

基于上述公式对个体营养级的判断相比于全组分骨胶原氮同位素比值具有更大的优势，因为他们无需利用初级生产者，即食物网基底的植物的δ15N进行表征，而是利用了单个生物体内两个氨基酸之间的同位素间距。因此，通过关注这些特殊的氨基酸，即可更精确的估算每种生物营养级位置并重建食物网结构。根据陆地C3类生态系统的计算方程式，对本遗址样品进行营养级位置估算，并对每个样本绘制δ15Nphe和δ15NGlu交叉参数分布图。详见图3。

图3 人和动物样品苯丙氨酸和谷氨酸的氮同位素值散点图Fig.3 Scatter plot of δ15NGlu and δ15NGlu values for the human and fauna samples

可以看出，食草类动物牛和羊的营养级位置在2左右(牛为2.0，羊稍低为1.8)，符合生物学预期的营养级位置。猪的营养级位置在2.1，仅微高于食草类动物，表明猪的饮食中蛋白的成分应该非常少。人的营养级位置从2.0到3.0，个体间差异较大。1个个体(Aus 16)具有最低的数值2.1，落于食草动物和猪的数值间，表明该个体应处于营养级的最低端，基本没有动物性蛋白的摄入。绝大多数个体营养级位于2.9左右，表明这群个体摄入了相当高的肉食资源，位于陆生生态系统食物链的顶端。有2～3个个体在2.6～2.7间，表明这些个体摄入的肉食蛋白比例相对低于其他个体(除Aus16)。

将利用δ15NPhe和δ15NGlu值计算出的营养级位置与应到个体骨胶原稳定氮同位素值进行对比(见图4)。以个体Aus1和Aus36为例，其δ15N值分别为13‰和10.6‰，相差近2.4‰。若仅用骨胶原δ15N值对其蛋白摄入情况进行判断，会认为这两个个体对肉食资源的摄取可能存在一定的差异。然而其苯丙氨酸和谷氨酸的氮同位素值表明其在营养级中都处于相同的位置2.9。而Aus16和Aus23两个个体则存在正好相反的情况。这两个个体具有非常接近的骨胶原δ15N值，分别为8.7‰和8.9‰，暗示其应该有着相似的蛋白摄入。然而单分子氨基酸氮同位素δ15NPhe和δ15NGlu值表明，其处于营养级的不同位置，2.0和2.6，即对肉食蛋白的摄入存在显著差异。Aus16个体为单纯的素食者，而Aus23个体摄入了相当量的动物性蛋白。

图4 人和动物样品营养级位置与骨胶原氮同位素值散点图Fig.4 Bulk δ15N values vs.trophic position for the human and fauna samples

根据骨胶原δ15N值对营养级情况进行的判断与由单分子氨基酸δ15NPhe和δ15NGlu值得出的结果存在一定程度的差异。前文所讲，骨胶原δ15N值是个体组成所有氨基酸δ15N值的整合，而个体间由于生理代谢或其他原因造成的差异往往被抵消，得不到应有的体现[14]。因此，仅利用骨胶原δ15N值分析个体蛋白摄入情况及判断其营养级位置可能会与个体真实的情况有较大的出入。以往的研究中，很多不同社会等级或不同性别、贫富差距的人群间，其骨胶原δ15N值并没有发现显著不同[15]。而本研究结果表明，仅利用骨胶原δ15N值可能在一定程度上忽略了个体食谱结构的差异，从而导致先民食谱的均一性。本研究结果对探寻人群食谱差异的研究提供了新的思路和证据，利用基于单分子氨基酸的同位素分析将提供个体更为准确的营养级位置信息，进一步提高对不同人群食谱结构差异研究的分辨率。

3 结 论

通过对突尼斯迦太基凡达里奇墓地出土人和动物骨骼进行骨胶原稳定碳氮同位素和单分子氨基酸同位素分析。研究表明，利用单分子氨基酸氮同位素比值对古代先民所处营养级位置能做出更为准确的判断，在揭示古代人类食谱差异上具有不可比拟的优势。对考古遗址出土人和动物骨骼开展该分析将极大提高古代食谱重建工作的分辨率，为精细化研究古代人群及社会提供重要依据。