m6A阅读者YTH蛋白的研究进展

王晓乐，马荣荣，鲁镇飞，马炜炜

(宁波市农业科学研究院 作物研究所，浙江 宁波 315000)

无论在真核还是原核生物中，基因的表达调控都是发生在转录水平和转录后水平上的多层次调控，这些过程对生物的生长、发育和生存都至关重要。近年来，关于RNA上化学修饰的研究逐渐使人们认识到这些化学修饰在基因表达调控中的重要性，而对于RNA上的化学修饰的研究被统称为表观转录组学。

在所有RNA化学修饰中，m6A是真核生物RNA中最常见也是分布最广泛的表观转录修饰。m6A修饰最早发现于20世纪70年代，当时人们猜测m6A修饰可能是一种mRNA潜在调节因子[1-2]。随后在酵母的研究中证实了m6A修饰水平是一个动态变化过程，并对酵母的生长发育至关重要。在酵母孢子形成过程中，m6A甲基转移酶的缺失抑制酵母孢子的形成，并阻断新个体的发育[3-4]。此后，研究者们逐渐发现m6A修饰具有多种生物学功能。在细胞及组织水平上，m6A影响细胞分化[5-7]、肿瘤形成[8-11]、节律钟调控[12]、神经发育及其功能行使[13]、果蝇性别决定[14-16]及X染色体沉默(XCI)[17]。在分子水平上，m6A修饰与mRNA的最终命运密切相关，一方面m6A通过破坏m6A所在区域的mRNA二级结构从而提高其附近区域与蛋白的结合能力[18]，另一方面m6A同样具有招募特定蛋白(也被称为READER阅读蛋白，如翻译起始因子eIF3和YTH蛋白)结合mRNA的功能[19-20]。Meyer等[21]研究发现，5′UTR区具有m6A修饰的mRNA能够招募eIF3蛋白并增强缺失eIF4E情况下的mRNA翻译过程。由于在环境胁迫或疾病情况下eIF4E的表达受抑制，因此，m6A依赖的eIF3蛋白招募在胁迫条件或疾病状态下可能至关重要[22]。尽管有若干关于eIF3与m6A互作的报道，但eIF3如何识别m6A并与之互作的分子机理研究却较少。与此相比，另一类m6A结合蛋白YTH蛋白则已有较为详尽的研究。本文我们将详细综述YTH蛋白在m6A修饰调控RNA过程中的功能多样性。

1 多样化的YTH蛋白

1998年Imai等[23-24]通过酵母双杂交法筛选TRA-2β(剪切复合体的组分)的互作蛋白时发现了第一个YTH蛋白，并将其命名为YT521-B。随后通过BLAST比对发现该蛋白中一段由140个氨基酸组成的区域在其同源蛋白中高度保守，遂将这一区域命名为YTH(YT521-B homologs)结构域[25]，而具有YTH结构域的蛋白也随之被命名为YTH蛋白。由于YTH结构域与RNA结合结构域RRM具有高度同源性，因此，YTH结构域被认为，可能是新的RNA结合结构域[25]。通过BLAST比对发现，几乎所有生物中均能找到YT521-B的同源蛋白或具有YTH结构域的蛋白，但秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans除外[26]。

前人对于YTH蛋白的研究主要集中在动物(特别是哺乳动物)中，并将动物YTH蛋白分为3大类：YTHDC1(YTH domain-containing protein 1)、YTHDC2(YTH domain-containing protein)和YTHDF(YTH domain-containing family protein)。除YTH结构域外，三者并无氨基酸序列相似性，蛋白大小和结构域排列也存在明显差异(图1)。虽然YTHDC1与YTHDC2名字相似但实际上除都具有YTH结构域外，两者并无同源关系。大部分无脊椎动物仅具有1个YTHDF亚家族的同源蛋白，而大部分脊椎动物则具有3个序列高度相似的YTHDF同源蛋白：YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。与YTHDC2具有多个结构域不同，YTHDF蛋白除C端的YTH结构域外缺乏其他可识别的蛋白结构域，其余部分为一段约350个氨基酸组成的富含P/Q/N的低复杂度区域。

图1 人YTH家族的蛋白结构域

与动物中的情况不同，植物中YTH蛋白的种类变化更为复杂。首先，通过同源比对发现植物没有YTHDC2的同源蛋白。其次，多数双子叶植物具有2个以上YTHDC1的同源蛋白，例如拟南芥具有2个，土豆具有4个；相较而言单子叶植物仅具有1～2个YTHDC1的同源蛋白，如水稻仅具有1个。最后，相较YTHDC1，YTHDF同源蛋白在不同植物(特别是被子植物)之间差异更为显著。虽然2个不同的研究小组都曾对植物YTHDF进行系统发育分析，并各自将植物YTHDF分为3个分支(Li等将3个分支命名为Group Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ，而Scutenaire等命名为YTHDFA/YTHDFB/YTHDFC)，但2个研究小组对每个分支的组成并不统一[27-28]。通过对动物及植物YTHDF蛋白进行系统发育分析发现，植物YTHDF蛋白与动物YTHDF蛋白的演化互相独立，植物YTHDF的3个分支与脊椎动物YTHDF1/2/3并无直接的对应关系(未发表数据)。除同源性差异外，YTHDF同源蛋白的数量在不同植物中也有显著差异，大豆、番茄、玉米等物种分别具有18、4以及16个。模式植物拟南芥和水稻虽然均具有11个YTHDF同源蛋白，但是两者的YTHDF蛋白并非全部直系同源[25]。植物中存在大量的YTH蛋白暗示植物YTH蛋白的功能可能更为复杂，有待我们进一步进行研究。

值得注意的是，并非所有YTH蛋白均具有YTH结构域。Devanshi等[29]深入研究不同物种YTHDC2时发现，尽管在大部分多细胞生物中均可发现YTHDC2的直系同源基因，但部分生物(哺乳动物鸭嘴兽，部分鸟类、两栖类和爬行动物，果蝇以及线虫)的YTHDC2显然缺少了YTH结构域。这一研究结果暗示YTHDC2蛋白可能逐渐不再依赖YTH结构域行使其生物学功能。

2 YTH蛋白识别m6A的分子机理研究

2.1 YTH蛋白结合特定m6A修饰模块

由于YTH结构域与RNA结合结构域RRM具有高度同源性，YTH结构域被认为同样具有RNA结合活性[25]。通过交联免疫沉淀技术(CLIP)研究细胞内YTH蛋白的结合靶标时发现，大部分哺乳动物YTH蛋白能够与RNA上某个含有m6A修饰的特定模块相结合[15,18,28]。

迄今为止，大量研究数据显示动物YTHDF蛋白主要结合在DR[m6A]CH(D=A/G/U，R=A/G，H=A/C/U)模块上[30]，且这一结果与通过meRIP方法测序获得的动物细胞内m6A的分布情况一致[31]。早期研究认为，哺乳动物YTHDF1和YTHDF2结合于不同的m6A修饰位点上，其重叠部分仅占所有测序位点的60%[32]。但Patil等[32]研究显示，哺乳动物不同YTHDF蛋白在转录组上结合位点的分布与m6A在mRNA上的分布情况完全一致，由此推断哺乳动物YTHDF蛋白对m6A修饰位点的结合并无偏好性。这一相反结论可能是由于2项研究采用了不同的方式对CLIP数据进行分析。早期研究更关注于不同YTHDF蛋白结合于哪些位点，因此，通过生物信息学方法仅对出现频率高于阈值的结合位点进行统计。然而这一方法对于阈值附近的结果如何取舍具有一定的随机性。Patil等[17]的研究则更倾向于关注每个m6A位点上结合的YTHDF蛋白的频率是否相近，并认为对于每个位点而言YTHDF1/2/3蛋白具有高度相似的结合比例。综上所述，不同YTHDF蛋白对于具有m6A修饰的RNA并无选择偏好性。

与动物YTHDF类似，动物YTHDC1与YTHDC2也主要与DRACH(D=A/G/U，R=A/G，H=A/C/U)模块结合，但与YTHDF蛋白不同的是YTHDC1定位于细胞核中[30]，因此，YTHDC1更倾向于结合ncRNA，特别是XIST[17]。而对于大部分m6A位点而言，除在特定条件下或特定类型细胞内，YTHDC2并无m6A结合能力[17]，这一结果与部分物种的YTHDC2蛋白丢失YTH结构域相佐证。

虽然植物具有更多YTH同源蛋白，但对植物YTH蛋白的结合模块研究较少。在研究拟南芥YTHDF蛋白ECT2(Evolutionary Conserved C-Terminal Region 2)的结合模块时发现，ECT2主要结合在URUAY(R=G>A，Y=U>A)模块上[33-34]。但对拟南芥茎、叶片及花器官中m6A修饰位点的研究揭示拟南芥m6A修饰位点主要为RR[m6A]CH(R=A/G，H=A/C/U)[35]，与动物中的m6A修饰位点相近，而与ECT2的结合模块不同。这2项相悖的研究结果是否说明其中一方的研究结果存在缺陷呢？值得注意的是，除经典的RRACH模块外，植物m6A修饰位点还存在其他类型。水稻愈伤组织中m6A修饰主要分布在RAGRAG(R=A/G)模块上[36]，而水稻叶片及玉米幼苗的m6A修饰则主要集中在UGUAMM(M=A/C)模块上[31,36]，其中UGUAMM模块与ECT2结合的URUAY模块具有一定程度的相似性。这些研究结果表明，在植物的不同组织中m6A修饰位点不同。结合植物中普遍存在较多YTH同源蛋白，我们推测植物YTH蛋白可能结合于不同的m6A修饰位点上并行使差异化的功能。

对拟南芥ECT2结合模块(URUAY)进一步研究发现，该模块位于Poly(A)位点上游30～150碱基处，且包含多聚腺苷酸化相关的UGUA序列，ECT2通过结合URUAY模块启动多聚腺苷酸化并维持靶标mRNA稳定性[34]，这一结果与动物YTHDF2诱导mRNA降解正好相反，进一步使我们猜测植物YTHDF蛋白可能发挥与动物并不相同的生理生化功能。

m6A修饰不仅存在于mRNA和ncRNA，也存在于18S和28S rRNA，那么YTH蛋白是否结合18S或28S rRNA上的m6A呢？rRNA上的m6A修饰位于一种A-m6A-C模块序列中[37]，iCLIP结果显示没有一个YTH蛋白结合在这些位点上[30]。近期对于人类核糖体结构的研究表明，18S和28S rRNA中的m6A位点均被包埋在核糖体亚基内部[38]。因此，iCLIP实验所显示的YTH蛋白不与rRNA m6A结合这一结果可能与YTH蛋白无法接触这些位点有关。

2.2 YTH蛋白结合m6A修饰的RNA的能力和模式

体外实验证明YTH结构域能够通过结合m6A进一步与RNA结合[19]。虽然关于YTH结构域和m6A修饰的RNA结合能力的研究结果不尽相同(部分研究认为其结合浓度需达到100～300 nmol，而使用YTHDF2的YTH结构域进行的RNA结合能力实验仅需1～3 μmol)，但相较需要5～10倍浓度才能与YTH结构域结合的未被甲基化的RNA，m6A修饰的RNA的确具有更强的YTH结构域结合能力[39-44]。与大部分仅需较低浓度(nmol级)即可结合的特异性RNA结合蛋白相比[45]，YTH结构域结合m6A修饰的RNA的能力并不强，这说明YTH结构域可能并不能独自与靶标RNA形成稳定的复合体，而是需要N端低复杂度区域序列辅助参与蛋白-RNA的互作。

3个独立研究小组分别研究了酿酒酵母(Zygosaccharomycesrouxii)甲基化RNA结合蛋白1(MRB1)、人源YTHDC1及YTHDC2与具有m6A修饰的RNA形成复合体的晶体结构[39-41,46]，结果表明，MRB1、YTHDC1及YTHDC2的YTH结构域使用了一套相似且保守的m6A识别机制，即m6A的甲基部分被由1个酪氨酸和2个色氨酸组成的芳香族笼状结构识别(图2)，腺嘌呤本身并不与3个氨基酸中的任何1个发生互作[39]。随后2个YTHDF蛋白(YTHDF1[42]及YTHDF2[43-44])的晶体结构相继报道，研究结果显示，两者的芳香族笼状结构与YTHDC1或YTHDC2略有不同，是由3个色氨酸组成，但同样能够识别N6-甲基基团。此后在对多个物种的YTH结构域比较后发现，组成笼状结构的这3个芳香族氨基酸在不同物种中高度保守[30]。

图示为酿酒酵母MRB1的YTH结构域部分结构，组成芳香族笼状结构的酪氨酸和色氨酸以球棍模型表示，3个氨基酸共同形成笼状疏水区域，结合m6A位点上的甲氨基团，m6A中的嘌呤环并不参与疏水互作。

值得注意的是裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)Mmi1蛋白是个例外，Mmi1蛋白虽然具有YTH结构域及芳香族笼状结构，却并不与m6A结合，而是结合1个未甲基化的RNA模块DSR(the determinant of selective removal motif，UUAAAC)[47]。而且，在DSR模块上添加m6A修饰并不会增强两者的结合能力，甚至在一些研究结果中反而降低了两者的结合能力。对Mmi1-DSR复合体的晶体结构研究显示Mmi1与RNA的结合面不同于典型YTH蛋白-RNA结合面，而是位于另一区域[47]。因此，Mmi1与未甲基化的RNA结合并不需要芳香族笼状结构的参与。

3 YTH家族的功能研究

3.1 YTH蛋白的分子生物学功能

m6A修饰最为广泛常见的分子生物学功能是起始mRNA翻译和介导mRNA降解[48]。除此之外，Patil等[30]认为,m6A以及YTH蛋白还能够调节可变剪切或基因组沉默等分子生物学过程(图3)。

A—通过招募SRSF10及磷酸化的SRSF3，YTHDC1启动特定mRNA前体剪切；B—YTHDC1结合XIST上的m6A诱导X染色体沉默；C—YTHDC1通过招募未磷酸化的SRSF3促进RNA向核外转运；D—YTHDF1通过与mRNA终止密码子及3′UTR区域附近的m6A结合，并招募eIF3及其他翻译起始元件从而调控翻译过程；E—YTHDF3通过与YTHDF1互作增强YTHDF1介导的翻译起始；F—YTHDF3引导m6A修饰的转录本与YTHDF2结合，进入RNA降解途径；G—YTHDF2与m6A结合并招募CCR4/CAF/NOT复合体使m6A修饰的mRNA发生脱腺苷化并降解。

3.1.1 YTH蛋白调控可变剪切

在被定义为m6A结合蛋白之前，YTHDC1最初被认为是启动外显子包含过程的调控因子[49]，而YTH结构域对于行使这一功能是必要的[48]。基于目前对YTH结构域的理解，YTHDC1对于mRNA剪切的调控依赖于与m6A的结合[49]。近期的研究显示YTHDC1通过招募2种竞争性mRNA剪切因子SRSF3(serine/arginine-rich splicing factor 3)和SRSF10行使其功能[47]。YTHDC1与磷酸化的SRSF3结合会启动外显子包含过程[48]，而与SRSF10的结合则启动外显子跳跃过程(图3 A)。但是关于m6A直接参与调控可变剪切的证据仍不充分。在METTL3干扰材料中，仅有不足100个含有m6A的外显子发生了可变剪切[19]。不仅如此，分析METTL3-/-老鼠胚胎干细胞中m6A介导的剪切情况时发现，仅有不足0.5%的外显子表现出了可变剪切，而其中不足100个外显子具有m6A位点[5,50]。

虽然哺乳动物细胞中m6A可能并不会影响全部mRNA可变剪切，但在果蝇(Drosophila)中已有确切的报道表明，m6A通过调控Sxl(sex-lethal)的可变剪切影响性别特异性基因的表达[14-16]。果蝇的性别决定过程与Sxl蛋白有关，当全长且具有生物学活性的Sxl蛋白存在时，子代表现为雌性果蝇，而当Sxl无法成功翻译全长蛋白时则为雄性果蝇。果蝇Sxl转录本的第二外显子中含有1个可提前终止Sxl蛋白翻译的终止密码子，因此，雄性果蝇的Sxl基因在翻译过程中提前终止，无法翻译出全长Sxl蛋白，最终表现为雄性果蝇。而在雌性果蝇中，第二外显子内的m6A修饰能够招募YT521-B(果蝇YTHDC1的直系同源基因)对Sxl转录本进行可变剪切，从而在mRNA成熟过程中剪切掉含有终止密码子的外显子，最终翻译出全长Sxl蛋白序列。m6A的缺失会阻断Sxl转录本的外显子跳跃过程，导致子代中雄性果蝇的数量增加。过表达YT521-B对雄性果蝇而言是致死的[15]，推测可能是因为过量表达YT521-B产生了类似雌性果蝇Sxl转录本类型，最终抑制了雄性果蝇中msl-2(male-specific lethal 2)基因的表达，导致雄性果蝇中出现异常X染色体剂量补偿效应。因此，在果蝇中m6A能够通过招募YT521-B直接引发特定基因的可变剪切事件。

3.1.2 YTH蛋白介导mRNA外运过程

在海拉细胞系中，YTHDC1介导m6A修饰的mRNA外运过程。YTHDC1首先与m6A结合，进一步与m6A修饰所在的mRNA结合形成mRNA-蛋白复合体(mRNPs)，该复合体招募未磷酸化的SRSF3和外运受体蛋白NXF1[51](图3中C)。值得注意的是SRSF3的磷酸化状态似乎与其行使的功能有关，YTHDC1与磷酸化的SRSF3结合启动外显子包含过程，而与未磷酸化的SRSF3结合则引发mRNA外运[51]。

3.1.3 YTH蛋白影响RNA降解过程

在哺乳动物中，YTHDF2作为m6A阅读蛋白之一能够诱导mRNA的降解。在海拉细胞系中，YTHDF2解码2 000种以上mRNA中的m6A编码，而敲除YTHDF2会引起这些mRNA含量显著上升，因此认为，YTHDF2与具有m6A修饰的mRNA的稳定性有关[20]。而这些受YTHDF2调控的mRNA的稳定性与其3′端的多聚腺苷化程度呈正相关，即相比其他mRNA，与YTHDF2结合的mRNA普遍表现出较短的多聚腺苷酸尾部[20]。体外实验发现METTL3甲基转移酶缺失时去腺苷化水平显著降低，这说明YTHDF2调控m6A修饰的mRNA稳定性与m6A修饰直接相关。TFA(Tethering reporter assay)实验还证明YTHDF2的N端结构域对去腺苷化极为重要[52]。综上所述，YTHDF2首先通过YTH结构域结合于m6A上，随后其N端结构域与CNOT1的SH(superfamily homolog)结构域互作，并招募CCR4/CAF/NOT复合体行使去腺苷化功能[52](图3中G)。早期研究认为，YTHDF2引导mRNA离开多聚核糖体进入p小体(富含mRNA-蛋白(mRNP)复合体，也包含mRNA降解因子，可能是mRNA的降解中心)，最终促进mRNA降解[20]。然而近期的研究似乎并不支持这一观点，Hubstenberger等[53]在p小体中几乎未观察到显著的mRNA降解事件，p小体更可能是作为mRNPs的储存及分拣中心。这一相悖结果使得我们需要重新考虑YTHDF2介导mRNA进入p小体的重要性。

另外，YTHDF1和YTHDF3也能影响具有m6A修饰的mRNA的稳定性。例如在海拉细胞系中，YTHDF1和YTHDF3引导m6A修饰的转录本与YTHDF2结合，进入RNA降解途径(图3中F)[26]。然而有趣的是，过表达YTHDF1蛋白24 h后，细胞中m6A/A比值不仅没有下降，反而上升了24%，推测可能是由于YTHDF1结合m6A修饰的mRNA引导其进入翻译过程(图3中D)起到了保护mRNA不被降解的作用[32]。

除mRNA外，YTH蛋白同样能够影响其他类型RNA的稳定性。人源YTHDF2能够与上千种环形内源RNA(circRNA)结合[26]。circRNA是RNA前体经过反向剪接内部重复序列形成的环状结构RNA。这些circRNA能够中和miRNA的功能或阻止RNA与蛋白的结合[26]。在敲除YTHDF2的细胞里，circRNA前体的半衰期远远短于其他类型的m6A修饰转录本。此外，m6A修饰并不影响成熟circRNA的稳定性。这些结果说明YTHDF2可能通过影响circRNA成熟过程或前体的稳定性来调控circRNA[54]。尽管如此，YTHDF2调控circRNA稳定性是否依赖于m6A修饰的腺苷酸残基仍有待探讨。

3.1.4 YTH蛋白影响RNA翻译过程

除影响RNA稳定性外，哺乳动物YTHDF1能够解码m6A修饰并在特定细胞类型或特定环境条件下影响靶标转录本的翻译过程[32,55]。在海拉细胞系中，YTHDF1能够结合某些mRNA终止密码子及3′UTR区域附近的m6A，并与48S翻译起始复合体中的eIF3(eukaryotic initiation Factor 3)互作，进一步招募其他翻译起始复合体成员及核糖体，从而提高翻译效率(图3中D)[32]。

最近的研究显示，其他YTHDF蛋白结合到报告基因的RNA上也会增强报告基因的翻译[56]。Shi等[57]发现，在海拉细胞系中YTHDF3通过与YTHDF1协作，促进60%的YTHDF1目标蛋白翻译，但YTHDF3既不能直接促进翻译也不能独自行使该功能。另一关于YTHDF3蛋白的研究也发现，YTHDF3不能独自起始报告基因的翻译，但YTHDF3的缺失会降低YTHDF1和YTHDF2对目标RNA的结合能力，同时YTHDF3还能促进YTHDF1起始的蛋白翻译过程[58]。因此，YTHDF3能通过增强YTHDF1与RNA的特异性结合从而间接提高m6A依赖的翻译效率(图3中E)。具有m6A修饰的circRNA的翻译过程则完全不依赖YTHDF1，但YTHDF3是必需的。YTHDF3通过招募直接结合于IRES(internal ribosome entry sites)上的eIF4G2，起始不依赖eIF4E的翻译过程[54]。除了YTHDF1/3之外，在鼠睾丸细胞和肝癌细胞中，YTHDF2也参与翻译调控过程[59-60]。体外TFA实验证明，YTHDC2降低报告基因表达的同时，却能诱导报告基因的翻译。

植物YTH蛋白同样能够参与类似过程的调控。拟南芥YTHDF蛋白ECT2定位于细胞核及细胞质中，组学研究表明ECT2同样与RNA翻译及降解过程有关，但具体机理仍不清楚。在胁迫条件(主要是热胁迫及盐胁迫)下，ECT2和ECT4重新定位于胁迫小体中(类似动物的p小体，主要负责mRNP复合体的储存与分拣)，部分与翻译相关因子共定位，这说明ECT2和ECT4可能与胁迫响应下的翻译下调过程有关[34]。与ECT2/4相比，ECT3并未出现这种类型的重新定位，可能是由于ECT3缺失了ECT2/4中富含YPQ的区域，在动物YTHDF蛋白中也发现了这一类似区域的存在。

3.1.5 YTH蛋白参与调控表观遗传组

核非编码RNA(ncRNA)XIST通过包被X染色体并招募染色质修饰因子(chromatin-modifying factors)随机沉默1条X染色体，因此，在雌性哺乳动物的X染色体沉默(XCI)中扮演着重要角色[61]。XIST至少有76个m6A修饰，YTHDC1通过结合XIST上的m6A从而调控XIST的活性。从胚胎干细胞中移除m6A修饰能够阻断XIST介导的X染色体基因沉默[17]，同样缺失YTHDC1也能阻断XIST介导的X染色体沉默过程，且该表型能被外源添加的YTHDC1-XIST复合体恢复[17]。因此，YTHDC1通过结合XIST的m6A位点诱导X染色体沉默的发生(图3中B)。

Wu等[62]研究发现，YTHDF2能够促进KDM6B的降解，而后者则能够促进多种促炎细胞因子上的H3K27me3去甲基化过程并增强促炎细胞因子的表达。同时H3K27me3也能抑制转录过程中腺苷酸上的甲基化过程，KDM6B通过招募m6A甲基转移酶从而移除靶标基因附近的H3K27me3修饰，并促进新转录出来的mRNA上的m6A修饰。这些结果证明在病毒侵染过程中，m6A与组蛋白甲基化存在某种程度上的互作，并共同行使功能。

综上所述，哺乳动物的YTH蛋白具有相似的分子生物学功能，但其功能是否冗余或是各有分工还需要进一步研究验证。那么植物中数量众多的YTH蛋白的分子生物学功能又是什么，相互之间是否冗余？这些问题仍有待进一步研究。

3.2 YTH蛋白的细胞学及生理学功能

3.2.1 性别决定及生殖系统发育

在小鼠中，YTHDC1对于生殖系统发育至关重要。在雄性小鼠中抑制YTHDC1的活性会导致精原细胞发育受阻，而在卵母细胞中缺失YTHDC1会引起上千种转录本发生可变剪切，多聚腺苷酸尾部及3′UTR区域长度改变，最终阻断卵母细胞成熟，说明YTHDC1对两性生殖细胞发育都非常重要。在果蝇中，YTHDC1的同源基因YT521-B通过改变下游基因Sxl转录本的可变剪切影响子代果蝇的性别[15]。

YTHDC2在哺乳动物生殖细胞中表达量较高，同样对于雌雄两性发育起着重要作用[26]。YTHDC2缺陷型小鼠虽然能够存活，但不论是雄性小鼠或是雌性小鼠均表现为不育，同时睾丸和卵巢发育较正常小鼠更小，这些生殖细胞发育缺陷是由减数分裂缺陷引起的。YTHDC2缺陷型小鼠的生殖细胞形成过程在减数分裂前期I受阻，产生大量异常减数分裂的中期细胞，最终提早进入细胞凋亡过程[63-66]。这些表型与MEIOC(Meiosis specific with Coiled-coil domain)缺陷型小鼠相似，后者可以与YTHDC2直接互作。在雄性或雌性生殖细胞中，YTHDC2与MEIOC共同下调一系列编码有丝分裂调节因子的mRNA，同时启动减数分裂相关基因表达[63-64]，值得注意的是，这些被下调的mRNA均富含m6A修饰，这说明YTHDC2可能通过结合m6A修饰负调控其目标基因。

3.2.2 干细胞维持与分化

Zhang等[67]研究斑马鱼甲基转移酶METTL3时发现，该基因对造血干细胞/祖细胞分化过程至关重要，而YTHDF2识别notch1α上的m6A修饰并使之降解，从而抑制内皮Notch信号通路，最终促进造血干细胞/祖细胞的分化。同样在小鼠中，YTHDF2能够结合多潜能基因的转录本，而这些转录本在缺失METTL3的情况下稳定性提高。YTHDF2与这些mRNA的结合开启胚胎干细胞的“超多能”状态，阻断其分化[68]。在肺癌研究中发现YTHDF2通过结合6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶3′UTR区的m6A修饰，从而促进6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的翻译过程并进一步促进肺癌的发生[11]。同时YTHDF2还能通过促进IL11(白细胞介素11)及SERPINE2的mRNA降解从而促进炎症反应介导的肝癌产生[69]。

在拟南芥中，去甲基化突变体表现出多种表型，包括胚发育停滞、生长抑制、茎尖分生组织异常、根系发生减少及向地性异常等[70-72]。体外和体内实验均证明拟南芥ECT2能够直接结合m6A修饰的RNA，且ECT2和ECT3均与叶片发生及发育有关[73]。然而，ECT2/3/4的任何1个单基因突变体并不会表现出显著的叶片发育缺陷表型，而三突突变体的叶原基中细胞分裂速率受抑制并表现出类似于去甲基化突变体的叶片表型[70,73-74]。这说明拟南芥中ECT2/3/4基因对于依赖m6A修饰的叶片发育调控过程可能是冗余的。除了参与叶片发育过程，ECT2和ECT3蛋白还与表皮毛状体发育有关。毛状体是一种生长于叶片上皮的伸长枝状单细胞，是表皮原细胞停止有丝分裂转而发生多次核内复制(细胞仅复制不分裂)过程的产物。核内复制的次数直接决定了分枝的数量，正常的成熟毛状体一般具有3个分枝。单独缺失ECT2或ECT3功能的拟南芥突变体表现出类似的毛状体数量及分支增加的表型，而在ect2/3双突变体中该表型则更为严重，说明ECT2和ECT3在毛状体发育过程中并非完全冗余[27]。在ect2单突变体中，ECT2功能的缺失引起至少3个与毛状体发生相关的具有m6A修饰的转录本发生快速降解或表达下调，造成表皮原细胞核内复制增加1次，产生具有更多分枝的毛状体[27,34]，但ECT2和ECT3调控表皮毛状体发育的完整分子机理仍有待进一步研究。

3.2.3 神经发育

在小鼠中，YTHDF1对于周围坐骨神经损伤后轴突再生过程是必需的，而在去甲基化突变体中也能观察到与YTHDF1缺陷个体相同的表型。这一结果说明，围绕m6A-YTHDF1行使的功能对周围神经系统创伤反应非常重要[55]。不仅如此，YTHDF1能够响应神经刺激，并促进海马体中神经元细胞内m6A修饰的mRNA的表达，从而影响成年老鼠的学习及记忆能力[75]。

敲除初代培养的神经元细胞m6A阅读蛋白会引起突触传导障碍并产生不成熟的树突棘[13]，沉默YTHDF3使轴突终末分支数量增多、PSD-95簇数量减少、AMPA受体表达降低。由此猜测神经元细胞末梢中的YTH蛋白与所处区域的m6A修饰的转录本互作并发挥功能，从而产生强烈的突触反应。此外还发现YTHDF1能够调控APC基因的翻译过程，而后者与神经元形态及神经发育有关。

除YTHDF外，其他YTH蛋白同样与神经发育有关。与果蝇神经系统中高水平存在的m6A修饰mRNA一致，果蝇神经系统中YT521-B(YTHDC1的同源基因)同样高表达。YT521-B或Ime4缺陷的果蝇表现出飞行或爬行功能缺陷[14-16]。同时人类基因组计划也发现YTHDC2的突变是自闭症谱系障碍的潜在风险因子之一[76]。综上所述，YTH蛋白对动物神经发育、运动、学习及记忆起着至关重要的作用。

3.2.4 胁迫响应

YTH蛋白在胁迫响应中发挥功能。当温度升高时，热休克相关转录本的5′UTR端会发生甲基化修饰，细胞质定位的YTHDF2进入细胞核中，与热休克基因mRNA上5′UTR区域的m6A位点结合从而保护该m6A位点。之后YTHDF2招募eIF3复合体并启动不依赖于帽结构的翻译过程[21, 77]。这一过程可能在其他类型的胁迫反应中也存在。此外，在热胁迫下m6A依赖的circRNA的翻译水平也显著升高。当细胞受到紫外线照射时，mRNA 5′UTR区域的m6A水平同样会显著升高，但这些m6A修饰以及其阅读蛋白的功能和作用机理仍未研究清楚[54,78]。

3.2.5 硝酸盐网络调控

CPSF30-L是拟南芥YTH蛋白家族的一员，具有典型的DC类型YTH结构域和CCCH类型锌指结构域。近期研究显示CPSF30-L能够调控硝酸盐吸收、信号转导、积累、内部运输及同化过程[79]。在硝酸盐调控网络中，CPSF30-L调控数个硝酸盐响应基因的表达，特别是硝酸盐转运蛋白NRT1.1。位于CPSF30-L第3个锌指结构域的点突变会引起NRT1.1表达水平降低和其3′UTR区域多聚腺苷酸长度缩短，硝酸盐同化基因表达升高，并且植株硝酸盐吸收量减少，根系硝酸盐还原反应增强、氨基酸含量增加[79]。这一表型只能由全长CPSF30-L蛋白来恢复，不具有YTH结构域的CPSF30-S则不能，这说明YTH结构域对CPSF30-L在硝酸盐代谢网络调控过程中至关重要，但该过程是否与m6A修饰有关仍有待探索。

4 小结与展望

从2012年发现m6A阅读蛋白至今，科研工作者们已经对m6A阅读蛋白在细胞内的功能进行了大量研究，包括维持正常的细胞活性和促进生殖、生长及发育过程等。YTH蛋白是m6A阅读蛋白中最为广泛研究的成员。从先前的研究中我们已经能够了解到YTH蛋白通过YTH结构域形成的芳香族笼状结构结合m6A的甲基基团并进一步与RNA结合，从而调控RNA的成熟、定位、翻译及降解等过程，最终影响生物体干细胞的维持与分化、生殖系统发育、神经发育和逆境响应等一系列过程。然而现有的研究主要还是以动物(特别是哺乳动物细胞系)YTH蛋白为模型，因此，对于YTH蛋白的功能研究仍有许多问题留待我们解决。

对于YTHDF蛋白而言，一个重要的问题就是这些蛋白的功能是冗余的还是分化的。YTHDF1与YTHDF2能够对同一个转录本上的m6A修饰竞争性结合，并产生截然相反的作用——启动翻译或降解mRNA。YTHDF蛋白之间也能够合作，在海拉细胞系中YTHDF3与YTHDF1或YTHDF2结合，辅助后者发挥功能。近期Li等[80]通过X晶体衍射等方法发现YTHDF1/2/3具有相似的与m6A互作模式，认为三者在细胞学功能上存在冗余性。在拟南芥中，ECT2和ECT3均对表皮毛状体形态建成至关重要，任何一个基因单独突变都会引起毛状体分支及数量改变，双突变体则表现出更为严重的毛状体发育缺陷。这些研究结果说明至少在一些特定发育过程中YTHDF蛋白并非完全冗余。然而就叶片发育角度而言，ECT2/3/4的任何一个基因的单突变体均没有显著的表型，仅在三突突变体中能够观察到类似去甲基化突变体的叶片形态，因此，在某些过程中YTHDF蛋白的功能似乎又存在冗余性。与哺乳动物仅具有YTHDF1/2/3 3个成员不同，植物YTHDF亚家族数量更多，亲缘关系更为复杂，此前的研究将植物YTHDF亚家族分为3个分支[27-28]，且不同植物物种在每个分支内部又存在数量不等的YTHDF同源蛋白，分支内同源蛋白之间是否存在功能冗余，分支间功能是否冗余？这些问题值得进一步在植物体内验证。

此外，YTH蛋白是否均通过与m6A结合行使功能也有待证实。在动物细胞中，YTHDC2定位于细胞质中并受肿瘤坏死因子α的诱导[29,81]，推测YTHDC2可能在一些特定的细胞类型中受外界刺激调控。利用自身的解旋酶结构域，YTHDC2解旋缺氧诱导因子1α(HIF1-α)的5′UTR区，增强其翻译效率[59]，但该过程是否与m6A有关仍未知。此外，YTHDF2通过结合核糖体RNA上的m5C从而促进rRNA成熟[82]，而YTHDF3则通过结合IGF1R转录本上的m1A并下调IGF1R的表达，从而抑制滋养层细胞浸润过程[83]。不仅如此，拟南芥YTHDC1的同源基因CPSF30-L参与硝酸盐代谢网络调控过程，该功能需要YTH结构域的参与，但是否需要m6A修饰的直接结合仍有待进一步证据证实。这些结果揭示YTH蛋白可能能够通过m6A以外的途径行使功能。

除了研究YTH蛋白的功能，对于“YTH蛋白是如何被调控的”这一问题仍知之甚少。YTHDF蛋白可能在不同组织类型或特定信号响应中受不同的调控。磷酸化蛋白组学研究揭示在YTHDF蛋白的富P/Q/N区域和YTH结构域附近存在大量磷酸化位点[84]。因此，YTHDF蛋白的翻译后修饰可能影响了LLPS(liquid-liquid phase separation)形成过程中YTHDF介导的蛋白成簇互作。除了磷酸化修饰，YTHDF蛋白还具有酰基化修饰[85]。然而YTHDF蛋白上翻译后修饰的改变是否受到了外源或内源刺激的诱导仍有待进一步研究。如果确实存在外界刺激诱导，那么这些翻译后修饰的YTH蛋白如何与其他蛋白或mRNA互作以及这些修饰如何影响YTH蛋白的亚细胞定位，这些问题都有待研究。至今为止，没有一条信号通路直接调控m6A，因此，任何关于YTH蛋白如何受到信号调控的信息都将拓展我们对于m6A调控机制的了解。

对m6A修饰的研究，特别是对m6A阅读蛋白YTH的研究虽然开展时间较短，但作为一种转录后调控机制，m6A修饰的分子机理研究正逐渐体现出其必要性及潜在应用价值。在许多疾病中，例如病毒侵染和不同类型的癌症，m6A扮演了非常重要的角色[56,86-93]。因此，研究者逐渐对开发针对m6A修饰复合体的小分子抑制剂或m6A竞争性结合小分子产生了新的研究兴趣。同样，深入研究植物(特别是农作物)中数量众多的YTH蛋白分子作用机理，回答其是如何影响作物生长发育并响应外界环境变化这一问题，对于精确调控作物生长，最终提高作物产量、减少化学肥料及农药使用至关重要。总而言之，深入研究m6A阅读蛋白为发掘表观转录组学在药物研发、作物育种等领域中的应用价值奠定理论基础。