设施番茄病毒病病原鉴定

孙晓军，周婷婷，玉山江·麦麦提，何 伟，罗文芳，许建军，阿布都赛买提·吐尔送

(1.新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆和田市农业技术推广站，新疆和田 848000)

0 引 言

【研究意义】番茄(Solanum lycopersicum)是一种栽培较广的蔬菜，亚洲最大的番茄种植基地在新疆。番茄作为新疆主要的特色经济作物[1]，其种植面积稳定在78.76×103hm2以上，产量达792.540 7×104t[2]。番茄病毒病是限制番茄产业发展的重要因素之一，对番茄具有致病力的病毒种类高达136种[3]。【前人研究进展】徐晨曦等[4]对2013年采自我国的170个番茄样本进行小RNA深度测序分析，鉴定出危害我国番茄的22种主要病毒，其采样地点未包括新疆。危害新疆番茄的病毒主要有CMV、STV、ToMV和PVY，且以STV、CMV及ToMV的复合侵染为主[5]，目前未见ToCV危害新疆番茄的报道。番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)是一种世界性重要病害，该病毒寄主范围广，传播迅速，潜伏期长，感病症状易与缺素症混淆，对产量造成损失，成为危害我国番茄产业发展的重要病害[6]。检测番茄褪绿病毒在新疆的发生状况，有助于制定科学的防治措施，控制其传播为害。ToCV属长线形病毒科Clostreoviridae毛形病毒属Crinivirus，是一种RNA病毒，不能通过机械摩擦接种传播，由媒介昆虫以半持久的方式传播[7]。1998年在美国佛罗里达州发现ToCV[8]。2004年在中国台湾发现该病毒[9]，目前在北京、天津、河北、河南、山东、湖南等地区已有该病毒的报道[10-16]。受ToCV感染的番茄表现为从中下部叶片显症并逐渐向上发展，叶脉间褪绿黄化，叶脉仍保持浓绿，感病叶片变脆且易折，与营养缺素症相似，果实膨大和转色迟缓。【本研究切入点】2019年秋，在新疆洛浦县设施番茄上发现ToCV疑似病株，且设施内烟粉虱数量较多。研究设施中感病番茄的病原，对病样进行分子检测鉴定。【拟解决的关键问题】采集新疆和田地区洛浦县不同温室种植番茄，进行番茄叶片总RNA提取和RT-PCR检测，并进行序列分析，分析番茄患病的病原，为新疆防控番茄病毒病的传播和危害提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

番茄病叶样品于2019年秋采集自新疆和田地区洛浦县不同番茄种植温室，共8份，将采集到的样品放置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 番茄叶片总RNA提取和RT-PCR检测

研究采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对病样进行鉴定。采用天根生物技术有限公司(北京)制造的试剂盒说明书提取植物总RNA提取。根据制造商的说明书(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，北京)将植物总RNA反转合成为cDNA。以cDNA为模板进行病毒的RT-PCR检测，引物信息如表1。PCR反应体系均为：2×easyTaqsuper Mix 10 μL、正反向引物各0.4 μL(10 mmol/L)、cDNA 1 μL、ddH2O补足至20 μL。反应程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。表1

表1 所用引物信息Table 1 Primer information used in this study

1.3 PCR产物克隆和测序

采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物技术有限公司，北京)回收PCR扩增到的特异性条带，纯化连接到pMD18-T克隆载体上，并转化大肠杆菌菌株DH5α，随机挑取3个阳性克隆送至华大基因公司测序。

1.4 序列分析

将得到的ToCVCP基因序列在NCBI网站中进行分析比对，根据比对结果，再选取NCBI上发布的ToCV分离物的CP基因完整序列。利用MEGA6.0软件的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法(neighbor joining, NJ)构建系统进化树，系统进化树中各分支置信度(bootstrap)进行1 000次重复分析。

2 结果与分析

2.1 番茄感染ToCV的田间症状

研究表明：设施番茄叶片具有明显的黄化现象，其症状和缺素症很相似。病株叶片褪绿从下部向上部发展，叶肉褪绿黄化，叶脉仍维持绿色，叶片边缘轻微向内卷曲，全叶变脆、增厚。图1

2.2 RT-PCR检测结果

研究表明，8份样本中未检测到TMV、CMV、ToMV、ToMMV，检测到STV(图2A)、TYLCV(图2B)、ToCV(图2C)，其检出率分别为100%、100%、87.5%。表2，图2

表2 洛浦县番茄病毒病原鉴定Table 2 Identification of tomato virus disease in Luopu County

2.3 ToCVCP基因序列

研究表明，从检测到ToCV的7个样品中选出1个作为代表性样本的PCR产物，克隆和测序得到774 bp序列，利用NCBI网站中BLAST功能对所得分离物的序列进行比对，该序列与ToCVCP基因序列相同，ToCV在新疆和田地区洛浦县已有发生。CP基因的3个阳性克隆测序结果一致。

将中国新疆洛浦县采集获得的ToCV分离物的CP基因与NCBI上来自中国的24份、日本2份、韩国3份、土耳其15份、希腊5份、巴西1份、以色列1份，共计51份ToCVCP基因序列进行同源性分析。中国新疆洛浦县ToCVCP基因序列与日本熊本(LC342729)和中国北京(KC311375)序列一致性达到99.74%，与来自中国其他地区19份、日本1份分离物的一致性达到99%以上。与来自中国其他地区的4份、希腊5份、土耳其14份、巴西1份、以色列1份，韩国的3份分离物的一致性达到98%～99%，与来自土耳其的1份分离物一致性达到96.12%。ToCVCP基因序列因分离物来源地区的不同而存在差异。中国新疆洛浦县ToCVCP基因与国内其他地区CP基因具有较高一致性，中国新疆洛浦县ToCVCP基因与希腊、土耳其、巴西、以色列等地区的分离物CP基因同源性较低。表3

表3 用于序列比较和进化分析的ToCV CP基因序列Table 3 Information of ToCV CP gene for sequence comparison and phylogenetic analysis

2.4 采集番茄病样ToCV 分离物的进化

研究表明，中国新疆洛浦县ToCVCP基因与中国北京、山东分离物的CP基因聚集在1个分支上，亲缘关系较近。与来自中国25份和日本的2份分离物聚集在同一个大的分支上，与来自希腊、以色列、巴西、韩国、土耳其的分离物亲缘关系相对较远。不同地区的ToCVCP基因序列存在一定差异，相邻地区的ToCVCP基因序列亲缘关系较近。图3

3 讨 论

研究采集了新疆和田地区洛浦县设施番茄疑似患病样品，利用RT-PCR方法检测患病植株叶片，经序列分析比对，造成新疆洛浦县番茄叶片黄化的病毒主要是STV、TYLCV、ToCV。其中，ToCV在新疆侵染番茄作物，获得新疆洛浦县番茄分离物的CP全基因序列。中国新疆洛浦县番茄分离物的CP核酸序列与GenBank登录的ToCV的CP核酸序列一致性均在90%以上。采集自中国新疆洛浦县番茄病样中确定检测到ToCV。

ToCV中国新疆洛浦县分离物的CP核酸序列与日本熊本(LC342729)和中国北京(KC311375)CP核酸序列一致性达到99.74%，与来自亚洲地区分离物的一致性高于希腊、以色列、巴西、土耳其地区的分离物。ToCV中国新疆洛浦县分离物与国内已报道分离物差异较小，与国外已报道分离物差异相对较大，中国新疆洛浦县番茄ToCV可能来自国内某个番茄ToCV发生区。

在自然条件下，多种植物病毒复合侵染植株的现象较为普遍，研究发现在同一地点采集的同一样本上也检测出TYLCV和STV，表明在和田地区洛浦县温室秋延晚番茄上存在2种及以上病毒复合侵染的问题。由于ToCV和TYLCV发病规律类似，发病时间相同，且均可由烟粉虱传播，2种病毒复合侵染产生的协生作用，将对番茄生产造成更大的经济损失[17]。

目前，国内外还未见有番茄品种抗ToCV的报道，也缺乏针对性的防治药剂。由于传毒介体-烟粉虱是造成ToCV发生、蔓延的关键因素之一，所以，通过控制传毒烟粉虱，阻断传播途径等措施综合防控ToCV。预防要做到早防早控，从播种、育苗、移栽、开花坐果直到采收，全程监测和防控传毒介体-烟粉虱，尤其是加强前期关键时期的防控管理，才能有效遏制ToCV的扩散和危害。

研究番茄病毒病病原鉴定的病样仅采自中国新疆和田地区洛浦县，将扩大对新疆其他地区ToCV的检测，进一步查明ToCV病毒在新疆发生分布的情况，为番茄病毒病的有效防治提供依据。

4 结 论

利用侵染番茄7种主要病毒的特异性引物对采自新疆洛浦县设施番茄疑似感病样品进行RT-PCR检测，从8份病样中检测到南方番茄病毒病(Tomatoyellowleafcurlvirus，STV)、番茄黄化曲叶病毒病(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)、番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)，其检出率分别为100%、100%、87.5%，未检出烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)、黄瓜花叶病毒(CucumbermosaicCucumovirus，CMV)、番茄花叶病毒病(Tobaccomosaicvirus，ToMV)、番茄斑驳花叶病毒(Tomatomottlemosaicvirus，ToMMV)。对番茄褪绿病毒阳性样品的CP基因进行克隆和序列分析，新疆洛浦县番茄病样分离物的CP基因的774个核苷酸序列与已报道的51个ToCVCP基因具有较高的同源性，与中国其它地区、日本、韩国、希腊、土耳其、巴西等地分离物一致性均达到96%以上，中国新疆洛浦县番茄病样分离的ToCVCP基因与北京、山东分离物的CP基因聚集在1个分支上，亲缘关系较近。新疆洛浦县设施番茄疑似病毒病植株的"黄化"现象，是由STV、TYLCV和ToCV中的2种或2种以上病毒复合侵染所致，并发现番茄褪绿病毒已传播至新疆和田地区。