年龄相关性听力减退与NR3C1基因SNP位点的关联性分析

宋婉雪江海英谭坦任继锋汪照国王炳玲段海平,*

1青岛大学公共卫生学院流行病与卫生统计学（青岛 266000）

2山东省青岛市城阳区疾病预防控制中心(青岛 266109)

3山东第一医科大学公共卫生学院公共卫生专业（泰安 271000）

4山东省青岛市疾病预防控制中心（青岛 266011）

年龄相关性听力减退(Age-related Hearing Impairment,ARHI)，又称为老年性耳聋(Presbycusis)，是一种严重影响老年人生活质量的感音神经性耳聋[1]。它表现为随个体年龄的增加而出现的双耳对称性、渐进性听力降低，首先是高频听力的下降，然后逐渐扩展到中低频率听力水平，最后发展成为全频听力水平的降低[2]。患有ARHI后不仅会对老年人的正常交流产生障碍，而且会使得老年人对于报警声等高频率声音不敏感，导致心理上孤独感产生以及生活危险性增加[3]。随着老年人口数逐渐增大，ARHI的患病情况不容乐观，预计在2025-2040年间导致我国老年人听力残疾原因主要是由ARHI引起的[4]，可见研究与ARHI发生有关的因素具有重要的疾病预防和人群意义。

现代医学研究证实ARHI与遗传因素和环境因素均有关[5,6]。目前提及较多的非遗传因素有环境噪声、吸烟、过度饮酒、高血压以及高血糖等[5,7,8]。还有多项研究显示40%-50%ARHI发病是由遗传因素所导致的[7,9]。以双胞胎队列和家庭队列为研究对象的纵向研究表明，ARHI的遗传度为25%-75%[10]。以往人类遗传学研究已经报道了许多ARHI相关基因，如 GRM7、SIK3、ESRRG、SOD2、GSTM1、GRHL2、TRIOBP等[6,11,12]。然而，关于糖皮质激素受体基因(Nuclear Receptor Subfamily 3,Group C,Member 1,NR3C1)与ARHI关系的研究很少。NR3C1基因在体内可以编码生成糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor,GR）。人内耳组织及实验动物研究表明GR主要分布于内耳的螺旋韧带、螺旋神经节、血管纹、Corti器中并且发挥着重要的生理作用[13]。

本研究旨在探讨青岛地区汉族老年人群中NR3C1基因与ARHI之间的关系，探究NR3C1基因的遗传易感性。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

通过整群随机抽样方法抽取青岛地区汉族非相关个体作为研究对象，本研究经青岛市疾病预防控制中心医学伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书并且自愿参与本项研究。

纳入标准：（1）年龄≥60岁的中老年人；（2）青岛市常住汉族居民（＞5年）；（3）能很好的配合此次的所有调查项目。排除标准：（1）有影响听力的疾病史、暴露史及用药史者；（2）无法配合完成问卷及各项检查者。

1.2 问卷调查

使用统一的调查方法、调查表进行调查，为了避免产生由于调查人员询问方式方法产生的偏倚，在调查前对调查工作人员进行统一培训。调查过程中选择安静的隔音房间、舒适的座椅、引导员维护秩序并对调查过程监督、一对一的询问等方法消除环境因素的影响。

问卷调查内容主要包括：研究对象的基本情况、吸烟饮酒情况、饮食和运动情况。研究对象基本情况包括：年龄、性别、DHI量表评分、是否对骨质疏松了解、身高改变与否、是否服用抗骨质疏松药物、糖尿病、心血管疾病、慢性肝病、骨密度、BMI、腰围、臀围。吸烟和饮酒情况包括：吸烟频率（从不/偶尔/经常）、吸烟量（每天0根/6根及以下/7-12根/13-18根/19根及以上）、饮酒频率（从不/偶尔/经常）、饮酒量（每次0ml/50ml及以下/50-99ml/100-149ml/150ml及以上）、被动吸烟频率（从不/偶尔/经常）。饮食和运动情况包括：饮绿茶和红茶频率（每周＜1次/每周1-3次/每周4-6次/每天1次/每天2-3次/每天4次及以上）、食坚果、油炸食品和牛奶的摄入频率（从不/偶尔/经常）、是否食用刺激性食物、是否每日蔬菜摄入、水果摄入（每周1-2次/3-4次/5-6次/7次及以上）、餐次（1/2/3）、几分饱（节食/七分饱/饱腹/过饱）、运动频率（从不/偶尔/经常）和运动时间（半小时/1小时左右/超过1小时）。

1.3 纯音听阈测试

测试前首先对研究对象进行外耳道清洁，休息片刻后进入指定符合规定的房间[≤40dB(A)]内由专业人员进行听力测试。使用纯音听力计（Orbiter 922,Madsen）并遵循《声学 测听方法》（GB/T 16296.1-2018）规定对研究对象使用上升法进行听力测试。从受试者自述听力较好耳开始分别测量左右两耳0.5、1.0、2.0、4.0kHz的纯音气导听阈，读数精确到1dB HL。

根据世界卫生组织1997年的推荐标准，以听力较好耳0.5、1.0、2.0、4.0kHz的纯音听阈平均值作为听力水平的判断标准：（1）≤25dB HL为听力水平正常；（2）＞25dB HL为患有ARHI。

1.4 基因分型

依据HapMap数据库和1000 Genomes选择候选基因的启动子、5′-非翻译区（5′-UTR）、内含子和3′-非翻译区（3′-UTR）等的功能性 SNP 位点，须满足在CHB人群中MAF＞0.05。最终，纳入NR3C1基因的9个SNP，分别是rs6191、rs61757411、rs41400245、rs258751、rs6196、rs41423247、rs6877893、rs12655166和rs33388。

根据SNP位点序列信息并采用AssayDesigner 3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物，并交由青岛欧易生物科技有限公司合成。NR3C1基因SNP位点的合成引物序列详见表1。

采集受试者4ml外周静脉血置于装有EDTA抗凝剂的试管中，-80℃保存备用。使用成品化DNA提取试剂盒（BioTeKe Corporation）提取血样中的DNA。然后通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,再加入单碱基延伸引物，这样探针在SNP位点处仅延伸一个碱基。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。

表1 NR3C1基因SNP位点的合成引物序列Table 1 The synthetic primer sequence of SNP locus of NR3C1 gene

1.5 统计学分析

计数资料间比较使用χ2检验。单因素和多因素Logistic回归探讨NR3C1基因与ARHI的关系。我们也同时进行了Hardy-Weinberg平衡检验验证样本的群体代表性。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本特征比较

本次调查共纳入研究对象共866人。其中男性347人（40.07%），女性519人（59.93%）。年龄为60-88岁。所有的SNP位点的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，说明样本具有群体代表性。

2.2 ARHI组与听力正常组间基因型分布情况比较

所有的SNP位点基因型分布在ARHI组和听力正常组间均不存在显著差异（P＞0.05），如表2所示。

2.3 ARHI组与听力正常组间等位基因分布情况比较

rs61757411、rs41423247、rs6877893等位基因分布在ARHI组和听力正常组间存在显著差异（P＜0.01），如表3所示。

表2 ARHI组与听力正常组NR3C1基因型分布比较Table 2 Genotype distribution of NR3C1 was compared between ARHI group and normal hearing group

表3 ARHI组与听力正常组NR3C1等位基因分布比较Table 3 The distribution of NR3C1 allele was compared between ARHI group and normal hearing group

2.4 NR3C1基因单个SNP位点与ARHI的关系

对NR3C1基因9个SNP位点的共显性、加性、显性、隐性和超显性五种遗传模型分析，在ARHI组和听力正常组的基因型频率及与ARHI的相关结果见表4。在未调整任何协变量情况下的单因素Logistic回归显示，对NR3C1基因9个SNP位点的共显性、加性、显性、隐性和超显性五种遗传模型分析，所有的SNP位点与ARHI之间均不存在统计学意义上的关联（P＞0.05）。

调整协变量基础上的多因素Logistic回归分析显示，rs6877893位点的加性模型（GG vs AG vs AA）下该位点与ARHI之间关联存在统计学意义（OR=0.733，95%CI：0.543-0.989，P=0.042）。

调整协变量基础上的多因素Logistic回归分析显示，rs33388共显性模型（TT vs AT）先与携带TT基因型的个体相比，携带AT基因型的个体患有 ARHI的危险性将会降低（OR=0.672，95%CI：0.453-0.996，P=0.048）；加性模型（AA vs AT vs TT）提示该位点与ARHI之间关联存在统计学意义（OR=0.723，95%CI：0.536-0.974，P=0.033）；显性模型提示相对于携带TT基因型的个体，携带（AT+AA）基因型的个体患有ARHI的危险性将会降低（OR=0.660，95%CI：0.454-0.960，P=0.030）。最后根据AIC选择了共显性模型为rs33388位点的最优遗传模型。

表4 NR3C1基因SNP位点与ARHI的关系Table 4 The relationship between SNP locus of NR3C1 and ARHI

C G 2 0 2 6 9 0.7 4 7（0.5 0 5-1.1 0 7） 0.1 4 6 C C 2 6 9 0.7 6 9（0.3 1 6-1.8 6 9） 0.5 6 2 A d d i t i v e C Cv s C Gv s G G 0.8 0 1（0.5 8 5-1.0 9 7） 0.1 6 7 7 5 5.4 4 5 D o m i n a n t G G 4 2 8 1 2 3 1.0（R e f.） 7 5 5.1 1 5 C G+C C 2 2 8 7 8 0.7 5 0（0.5 1 4-1.0 9 4） 0.1 3 5 R e c e s s i v e G G+C G 6 3 0 1 9 2 1.0（R e f.） 7 5 7.2 0 9 C C 2 6 9 0.8 5 0（0.3 5 4-2.0 4 4） 0.7 1 7 S u p e r d o m i n a n c e G G+C C 4 5 4 1 3 2 1.0（R e f.） 7 5 5.4 3 9 C G 2 0 2 6 9 0.7 6 1（0.5 1 6-1.1 2 1） 0.1 6 7 r s 6 8 7 7 8 9 3 C o d o m i n a n t A A 4 0 8 1 1 5 1.0（R e f.） 7 5 6.7 0 3 A G 2 1 8 7 4 0.7 1 5（0.4 8 4-1.0 5 6） 0.0 9 2 G G 3 1 1 3 0.5 6 4（0.2 5 8-1.2 3 2） 0.1 5 1 A d d i t i v e G Gv s A Gv s A A 0.7 3 3（0.5 4 3-0.9 8 9） 0.0 4 2 7 5 6.7 4 0 D o m i n a n t A A 4 0 8 1 1 5 1.0（R e f.） 7 5 7.0 3 A G+G G 2 4 9 8 7 0.6 9 1（0.4 7 6-1.0 0 2） 0.0 5 1 R e c e s s i v e A A+A G 6 2 6 1 8 9 1.0（R e f.） 7 5 9.5 2 5 G G 3 1 1 3 0.6 3 5（0.2 9 4-1.3 6 8） 0.2 4 6 S u p e r d o m i n a n c e A A+G G 4 3 9 1 2 8 1.0（R e f.） 7 5 8.6 8 3 A G 2 1 8 7 4 0.7 5 0（0.5 1 2-1.1 0 1） 0.1 4 2 r s 1 2 6 5 5 1 6 6 C o d o m i n a n t T T 5 0 1 1 5 7 1.0（R e f.） 7 5 8.9 3 6 C T 1 4 7 4 2 1.2 5 6（0.8 0 2-1.9 6 8） 0.3 1 9 C C 9 2 1.5 0 5（0.2 7 3-8.2 9 7） 0.6 3 9 A d d i t i v e C Cv s C Tv s T T 1.2 5 0（0.8 3 4-1.8 7 5） 0.2 8 0 7 5 8.9 3 9 D o m i n a n t T T 5 0 1 1 5 7 1.0（R e f.） 7 5 8.9 7 9 C T+C C 1 5 6 4 4 1.2 6 9（0.8 1 9-1.9 6 8） 0.2 8 7 R e c e s s i v e T T+C T 6 4 8 1 9 9 1.0（R e f.） 7 5 9.9 4 6 C C 9 2 1.4 4 2（0.2 6 2-1.9 2 9） 0.6 7 4 S u p e r d o m i n a n c e T T+C C 5 1 0 1 5 9 1.0（R e f.） 7 5 9.1 6 9 C T 1 4 7 4 2 1.2 4 9（0.7 9 8-1.9 5 6） 0.3 3 0 r s 3 3 3 8 8 C o d o m i n a n t T T 4 1 1 1 1 4 1.0（R e f.） 7 5 7.1 7 1 A T 2 1 3 7 5 0.6 7 2（0.4 5 3-0.9 9 6） 0.0 4 8 A A 3 4 1 3 0.5 9 9（0.2 7 7-1.2 9 7） 0.1 9 4 A d d i t i v e A Av s A Tv s T T 0.7 2 3（0.5 3 6-0.9 7 4） 0.0 3 3 7 5 7.4 8 4 D o m i n a n t T T 4 1 1 1 1 4 1.0（R e f.） 7 5 7.2 4 9 A T+A A 2 4 7 8 8 0.6 6 0（0.4 5 4-0.9 6 0） 0.0 3 0 R e c e s s i v e T T+A T 6 2 4 1 8 9 1.0（R e f.） 7 6 1.0 7 8 A A 3 4 1 3 0.6 8 9（0.3 2 3-1.4 7 1） 0.3 3 6 S u p e r d o m i n a n c e T T+A A 4 4 5 1 2 7 1.0（R e f.） 7 5 8.7 9 5 A T 2 1 3 7 5 0.7 0 3（0.4 7 8-1.0 3 4） 0.0 7 4

3 讨论

人体随着年龄的逐渐增加会出现各种老化的现象，比如皮肤组织表现为色斑以及皱纹增加，而ARHI发生正是因为听觉系统逐渐衰老所导致的[2]。虽然人体都会经历逐渐衰老的过程，但是ARHI的发生时间、严重程度、进展速度却存在明显的个体差异。并且研究显示ARHI发生与遗传因素密切相关，所以研究ARHI的遗传背景具有重要意义[7,9]。

本研究显示 rs61757411、rs41423247、rs6877893等位基因分布在ARHI组和听力正常组间存在显著性差异。在控制环境因素的多因素Logistic回归分析显示，rs6877893位点的加性模型与ARHI之间关联存在统计学意义，rs33388共显性模型、加性模型、显性模型与ARHI之间关联存在统计学意义，提示NR3C1基因多态性与ARHI存在关联。目前对于NR3C1基因与ARHI之间的相关研究较少，一项非综合征型耳聋研究从人或老鼠的耳蜗中分离到特异表达的耳聋候选基因中包含NR3C1基因[14]。有研究利用基因表达谱芯片在人群中对糖皮质激素受体相关基因进行检测显示糖皮质激素受体在ARHI组与对照组间基因表达存在不同，提示糖皮质激素受体与ARHI存在相关[15]。其它对NR3C1基因研究显示rs41423247位点与心血管疾病危险因素、腹型肥胖、高血压、糖尿病存在相关性，这些因素均为目前研究揭示的ARHI危险因素，所以NR3C1基因多态性可能会引起内耳循环改变的相关疾病从而导致ARHI的发生[16-18]。

NR3C1基因位于人体5号染色体上，由9个外显子构成，其编码的糖皮质激素受体（GR）属于核激素受体超家族，并且研究表明GR在内耳分布[13]。下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）分泌的GC对听力的保护作用需要GR的参与[19]。动物实验表明，患有ARHI小鼠内耳存在毛细胞凋亡和听神经退行性改变[20]。GR介导的听力保护可能与调控凋亡相关蛋白的表达有关。抑制凋亡诱导因子(AIF)Fas或Bcl-2蛋白家族中促凋亡成员的表达，上调Bcl-2蛋白家族中抗凋亡成员的表达均可发挥抗凋亡作用[11]。例如，地塞米松可能通过基因组作用上调Bcl-2和Bcl-x1来抵抗TNF-α的耳毒性作用[21]。耳蜗侧壁的血迷路屏障(blood labyrinth barrier,BLB)可以将耳蜗微环境与血液循环隔离开来，长期以来人们认为内耳内是不存在免疫反应的。然而，随着深入研究发现ARHI患者的耳蜗有炎症反应。在60岁以下存在听力减退的人群中血清TNF-α和CRP浓度显著升高[22]。高龄小鼠耳蜗组织内发现了ROS的产生以及IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α浓度显著升高[23]。这都提示炎症和免疫反应是ARHI发生发展的重要机制。GC通过GR信号通路具有明显的抗炎和免疫抑制作用。发挥主要抗炎作用的GR-α进入细胞核后，与DNA上的GC反应元件结合使其结构发生改变，通过抗炎蛋白的表达影响转录过程，抑制炎症反应[24]。

本研究首次选取了青岛地区汉族老年人群作为研究对象来探讨NR3C1基因多态性与ARHI之间的关系，研究显示NR3C1基因多态性与ARHI存在关联性，提示今后可以考虑将NR3C1基因作为中老年人听力筛查的目标基因。但是由于ARHI是一个多基因疾病，所以在听力筛查中不应仅将本次研究的NR3C1基因作为目的基因，还应该结合以往的研究把有意义的基因也纳入其中作为目的基因，比如：GRM7、SIK3、ESRRG、SOD2、GSTM1、GRHL2、TRIOBP等。SNP位点选取时可以考虑选择研究报道过的有意义的位点对高危人群进行筛查，从而提高筛查的质量。同时也应把噪声环境工作者以及受环境噪声污染等人群也应考虑在内。经筛查上述基因已呈现多态性时，应考虑调离工作岗位、佩戴隔音耳塞、早期佩戴助听器等积极有效措施延缓ARHI发病进程。这为今后开展多中心、大人群、多SNP位点的研究提供了重要参考，并且为ARHI高危人群的筛查和预防提供了科学依据。本研究尚有不足之处，rs61757411、rs41423247、rs6877893、rs33388外其余没有显著统计学意义的SNPs，我们考虑其原因可能是样本量相对较小，在今后的研究中我们会继续增加样本量并且更深入的研究。