MMP-3 和CCN2 在牙髓损伤模型大鼠牙髓组织中的表达及其意义

李梦洁, 谢金芳, 尹 硕, 刘 霞

（1. 吉林大学口腔医院综合口腔治疗科，吉林 长春 130021；2. 河南省郑州市口腔医院牙体牙髓科，河南 郑州 450000；3. 吉林省长春市口腔医院修复科，吉林 长春 130041）

牙髓组织受到外界刺激时，牙齿硬组织和软组织释放较低水平的炎症性分子，可引起牙本质-牙髓复合体产生类似于再生修复的反应，通过上调P38 蛋白的信号传导核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 途径，使牙髓的炎症反应最小化，同时提供更有利的内在环境，促使牙齿硬组织进行自身修复［1-3］。损伤的应答和修复是一个复杂的生物过程，涉及多种因子介导的一系列细胞、蛋白和细胞因子间的级联反应，但其具体机制目前尚不清楚。

基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）作为MMPs 家族的重要成员，参与正常及病理性的组织形成［4-5］。MMP-3 在正常细胞和肿瘤细胞的迁移中作为非常重要的调控因子，在很多方 面 起 着 正 负 调 控 的 作 用［6-7］。DANIELS 等［8］研究发现：创伤后不同时间点创伤组织中均可见MMP-3 表达，直至损伤后28 d，提示MMP-3 不仅参与了细胞外基质降解，也与细胞外基质重塑和组织改建有关。研究［9］表明：MMP-3 在难愈创伤动物模型组织中呈高表达，有促进创伤修复的作用。结缔组织生长因子2 （connective tissue growth factor 2，CCN2） 是CCN 家族成员之一，现已发现多种类型的细胞可以产生CCN2［10-11］，其在胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖及分化、血管形成和肿瘤发生等方面均发挥重要的作用［12-13］。研究［14-15］显示：MMP-3 和CCN2 在骨和软骨的发生发展过程中有相互作用，体外研究也证实CCN2 在MMP-3 的诱导下可以促进牙髓细胞的增殖、迁移和血管的再生。但MMP-3 和CCN2 在牙髓损伤修复中的表达变化及其关系目前尚不明确。

本研究通过建立大鼠牙髓损伤模型，采用HE 染色和免疫组织化学染色法观察MMP-3 和CCN2 在大鼠牙髓损伤修复过程的表达情况，以探讨其在牙髓损伤修复过程中的可能作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器清洁级雄性8 周龄Wistar 大鼠28 只，体质量180～200 g，购自吉林大学实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK（吉） 2008-0011。10%EDTA 液和4% 多聚甲醛（北京恒业中远化工有限公司），速眠新（吉林省华牧动物保健品有限公司），乙醚（长春市永辉化工商贸有限公司），兔抗大鼠MMP-3 多克隆抗体、兔抗大鼠CCN2 多克隆抗体、SABC 免疫组织化学染色试剂盒和DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物有限公司），其他常规试剂均购于上海化学试剂公司。1/4 钨钢球钻（日本Mani 公司），高速涡轮机（上海医用仪器设备厂），CX21 光学显微镜（日本Olympus 公司），自制开口器。

1.2 牙髓损伤动物模型建立和标本制备大鼠健康状况良好，混合饲料喂养，自由饮水。将大鼠平均分为7 组，每组4 只，随机选取一组为对照组，其余6 组分别为损伤后0 h 组、6 h 组、1 d 组、3 d 组、7 d 组和14 d 组。除对照组外，其余各组大鼠采用单纯开放法制备上颌磨牙牙髓损伤模型：大鼠经乙醚麻醉，肌注速眠新（0.2 mL·kg－1） 后取仰卧位，将四肢及上颌固定于手术板上。2%碘伏消毒口腔，用1/4 球钻在大鼠双侧上颌第一磨牙面开髓，透粉时停止操作，探针穿髓，生理盐水冲洗，无菌棉球压迫止血并干燥窝洞，此时造模成功［1］。所有窝洞制备由同一名经验丰富的临床医生单独完成。术后大鼠正常环境饲养，分别在上述不同时间点将大鼠乙醚深度麻醉后固定四肢，打开胸腔暴露心脏，将针头刺入左心室，剪开右心耳，以引出血液和灌流液。先用输液器缓慢注入生理盐水，直至流出液变清亮，然后注入4%多聚甲醛约30 min。待组织变硬立即断头，取上颌骨置于4%多聚甲醛溶液中48 h，经10%EDTA 脱钙10 周后，近远中向修块，脱水，透明，浸蜡，包埋，制备厚度为4 μm 连续切片。

1.3 HE 染色观察大鼠牙髓组织病理形态表现选取通过穿髓点的切片，常规脱蜡至水，苏木素染色10 min，流水冲洗；1%盐酸乙醇分化1～3 s，流水冲洗；氨水返蓝5～10 s、0.5%伊红溶液染色5 min，流水冲洗5 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察各组大鼠牙髓组织病理形态表现。

1.4 免疫组织化学染色检测大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 的定位及蛋白表达水平选取通过穿髓点的切片在60℃干燥箱内干燥3 d，使组织与玻片更密贴。切片在常温下脱蜡至水，PBS 缓冲液冲洗3 min×3 遍，置于保湿盒中。室温下滴加复合消化酶10 min，PBS 缓冲液冲洗3 min×3 遍；滴加3% H2O2去 离 子 水10 min，PBS 缓 冲 液 冲洗3 min×3 遍；滴加0.1%Tritonx-100 液10 min，PBS 缓冲液冲洗3 min×3 遍；滴加5%BSA 封闭液20 min 后甩掉；分别滴加兔抗鼠的多克隆抗体（武汉博士德），4℃冰箱过夜；滴加羊抗兔的二抗（北京中杉）20 min，PBS 缓冲液冲洗5 min×3 遍；滴加SABC 试 剂 常 温20 min，PBS 缓 冲 液 冲 洗5 min×3 遍；滴加新鲜配置的DAB 显色液镜下显色，水洗后苏木素轻度复染，树胶封片，镜下观察。阴性对照以PBS 缓冲液代替一抗。在高倍镜下从每张切片的染色阳性区各随机选取3 个不重叠区域，用Image-Pro Plus 6.0 软件测其阳性区的平均吸光度（A） 值，并取均值代表MMP-3 和CCN2 蛋白表达水平。

1.5 统计学分析采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用多因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠牙髓组织病理形态表现对照组大鼠牙髓组织中可见成牙本质细胞层、乏细胞层、多细胞层和固有牙髓分界清楚；外层成牙本质细胞呈栅栏状排列紧密、整齐，内侧成纤维细胞排列均匀，呈星形，胞浆突起相互连接，间质可见血管、纤维。损伤后0 h 组，大鼠牙髓组织中可见血管轻度扩张，其他无明显变化。损伤后6 h 组，大鼠穿髓孔下方牙髓组织中可见成牙本质细胞核固缩，胞体呈扁平状排列，血管扩张明显，可见散在炎症细胞。损伤后1 d 组，大鼠牙髓组织中可见血管扩张及新生血管，穿髓孔下方牙髓乏细胞层消失，牙髓细胞生长活跃。损伤后3 d 组，大鼠穿髓孔下方牙髓组织中可见大量炎症细胞聚集，血管新生明显；炎症下方成纤维细胞增殖明显，呈星形；成牙本质细胞排列紊乱。损伤后7 d 组，大鼠穿髓孔下方牙髓组织炎症减轻，前期牙本质明显增厚，可见骨样钙化团块出现，成牙本质细胞排列紊乱，牙髓组织中可见大量增殖的星形细胞。损伤后14 d 组，大鼠开髓点下方有修复性牙本质生成，较牙本质密度低；牙髓组织中增殖细胞排列紊乱，可见少量炎症细胞。见图1。

2.2 各组大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 的定位对照组大鼠牙髓组织中几乎检测不到MMP-3的表达。损伤后0 h 和6 h 组，MMP-3 在大鼠穿髓孔下方牙髓组织间质中呈弱阳性表达。损伤后1 d组，MMP-3 在大鼠穿髓孔下方牙髓组织成牙本质细胞及细胞间质中呈阳性表达。损伤后3 d 组，MMP-3 在大鼠成牙本质细胞中呈强阳性表达，在淋巴细胞和中性粒细胞只表达于胞核中，在增生的血管内皮细胞和成纤维细胞胞浆中呈阳性表达。损伤后7 d 组，MMP-3 在大鼠牙髓组织钙化团块中无表达，而在其周围细胞可见强阳性表达，此外在成牙本质细胞和成纤维细胞的胞质中呈强阳性表达。损伤14 d 组，MMP-3 在大鼠新形成的修复性牙本质中无表达，在牙髓组织中的表达明显减弱。见图2。

对照组大鼠牙髓组织中几乎检测不到CCN2 的表达。损伤后0 h 和6 h 组，CCN2 在大鼠穿髓孔下方牙髓组织间质中呈弱阳性表达。损伤后1 d 组，CCN2 在大鼠穿髓孔下方牙髓组织成牙本质细胞及细胞间质中呈阳性表达。损伤后3 d 组，CCN2 阳性表达细胞分布广泛，集中于大鼠穿髓孔下方牙髓组织淋巴细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞的胞浆中。损伤后7 d 组，大鼠牙髓组织中钙化团块周围可见CCN2 强阳性表达，增殖的成纤维细胞和星型细胞中也可见CCN2 强阳性表达，主要位于胞浆中，此外少量炎症细胞中也可见CCN2 阳性表达。损伤后14 d 组，CCN2 在大鼠新形成的修复性牙本质中无表达，在修复性牙本质下方成牙本质细胞中呈阳性表达，其表达较损伤后7 d 组减弱，胞核中未见CCN2 表达，细胞间质中可见CCN2 弱阳性表达。见图3。

图1 各组大鼠牙髓组织病理形态表现（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of pulp tissue of rats in various groups（HE，×200）

2.3 各组大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 蛋白表达水平与对照组比较，损伤后不同时间组大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05）；与损伤后0 h 组比较，损伤后6 h组大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），损伤后1、3、7 和14 d 组大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05）。见表1。

图2 各组大鼠牙髓组织中MMP-3 蛋白表达情况（免疫组织化学，×200）Fig.2 Expressions of MMP-3 protein in pulp tissue of rats in various groups（Immunohistochemistry,×200）

图3 各组大鼠牙髓组织中CCN2 蛋白表达情况（免疫组织化学，×200）Fig.3 Expressions of CCN2 protein in pulp tissue of rats in various groups（Immunohistochemistry,×200）

3 讨 论

目前临床上针对根尖孔未形成，因机械性、外伤或龋源性因素点状露髓的年轻恒牙，以及根尖已完全形成的意外穿髓、穿髓孔直径不超过0.5～1.0 mm 的恒牙，可以采用直接盖髓术来保存活髓。常用盖髓剂是氢氧化钙和矿物三氧化物凝聚体（mineral trioxide aggregate，MTA），其具有杀菌、灭活内毒素和诱导硬组织形成等作用，但存在盖髓点下方形成坏死硬化层和不能良好地还原牙髓活力等缺点［16-17］。已有研究［18-20］显示：牙髓损伤后具有一定抵御刺激、进行自身修复的能力。牙髓干细胞可从深层牙髓组织向创伤表面迁移和增殖，并分化为成牙本质样细胞，进而形成修复性牙本质，在此过程中，血管不断地向组织供给营养及氧气，排出代谢产物及废物，维持干细胞和前体细胞的迁移及供给平衡［21-22］。该修复潜能是牙髓组织固有的一种生物学机能，也是临床工作中牙髓活髓保存治疗的理论基础。牙髓干细胞迁移、增殖以及血管形成是牙髓修复的基础，但此过程的分子学机制目前尚不清楚。

表1 各组大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 蛋白表达水平Tab. 1 Expression levels of MMP-3 and CCN2 proteins in pulp tissue of rats in various groups （n=4，）

表1 各组大鼠牙髓组织中MMP-3 和CCN2 蛋白表达水平Tab. 1 Expression levels of MMP-3 and CCN2 proteins in pulp tissue of rats in various groups （n=4，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with 0 h after injury group.

Group Control After injury 0 h 6 h 1 d 3 d 7 d 14 d MMP-3 0.078 8±0.005 4 CCN2 0.069 6±0.004 7 0.141 2±0.003 9*0.147 1±0.006 5*0.190 6±0.001 5*△0.272 1±0.005 1*△0.378 8±0.006 2*△0.236 8±0.010 1*△294.485＜0.01 FP 0.136 2±0.004 8*0.137 2±0.004 7*0.186 7±0.003 5*△0.265 9±0.007 8*△0.339 0±0.008 3*△0.224 7±0.003 8*△89.977＜0.01

MMP-3 和CCN2 是很好的促进创伤愈合的细胞因子，可以促进细胞的增殖、黏附和分化，对创面的愈合、血管和神经的再生也有很强的促进作用。本研究采用单纯开放法制备大鼠牙髓损伤模型，HE 染色显示：牙髓损伤后1 d 可见血管扩张、新生血管；牙髓损伤后3 d 可见大量炎症细胞聚集、血管新生明显，在一定程度上表明早期炎症反应是牙髓损伤修复中关键的部分；牙髓损伤后7 d 开髓点下方牙髓组织炎症减轻，前期牙本质明显增厚，可见骨样钙化团块出现，说明牙髓已出现修复性反应；直至牙髓损伤后14 d 开髓点下方有明显修复性牙本质生成，炎症减轻，说明大鼠牙髓损伤模型成功建立。已有国外学者［8］发现：MMP-3 可以通过降解牙本质基质蛋白1 （dentin matrix protein-1，DMP-1）促进牙髓细胞的增殖和分化，CCN2 可以促进修复性牙本质的形成。本研究中免疫组织化学染色结果显示：正常大鼠牙髓组织中无MMP-3 和CCN2 表达，牙髓损伤后0 h 至7 d 时间段牙髓组织中MMP-3 和CCN2 表达逐渐增强，损伤后14 d MMP-3 和CCN2 表达水平下降。本研究中，随着牙髓损伤时间的延长，牙髓组织中MMP-3 和CCN2 表达位置也有明显改变：MMP-3 首先表达在穿髓孔下方牙髓组织的间质中，3 d 时在炎症细胞的胞核中表达，成牙本质细胞中表达明显，7 d时成纤维细胞中可见MMP-3 高表达；CCN2 同样首先表达在穿髓孔下方牙髓组织的间质中，3 d 时在炎性细胞胞浆和血管壁中高表达，7 d 时于成纤维细胞和成牙本质细胞胞浆中高表达，14 d 后表达减弱。本研究结果表明：MMP-3 和CCN2 在牙髓炎症的初期和中期增强了成牙本质细胞和成牙本质细胞样细胞的活跃性；MMP-3 和CCN2 在牙髓损伤后不同时间点不同程度地表达于牙髓不同位置，说明MMP-3 和CCN2 在牙髓损伤后的细胞增殖、组织重建过程中发挥一定作用。MMP-3 在牙髓感染中具有抑制炎症的作用［23］，而CCN2 在体外能够促进成牙本质细胞样细胞的增殖和成牙基因的表达［13］；在牙髓受到损伤后感染的初期，牙髓组织内细胞分泌MMP-3 和CCN2 是机体发挥防御反应的一种表现，但MMP-3 和CCN2 是否共同发挥作用尚不明确。

综上所述，MMP-3 和CCN2 在大鼠牙髓损伤修复过程中特异性表达，并且很可能在牙髓细胞牙源性分化过程中及牙本质修复性再生时起重要作用，其具体作用机制有待进一步研究。