姜黄素对高胆固醇血症模型大鼠脑微循环障碍的改善作用及其机制

李红芳, 杨 绍, 曹莫寒, 袁丽丽, 李晓琎, 史才兴, 王茁桠, 亚白柳

（1. 济宁医学院附属医院神经内科，山东 济宁 272029；2. 济宁医学院中西医结合学院，山东 济宁272067；3. 济宁医学院基础医学院，山东 济宁 272067；4. 济宁医学院基础医学院组织学与胚胎学教研室，山东 济宁 272067；5. 济宁医学院基础医学院生理学教研室，山东 济宁 272067）

高胆固醇血症与缺血性脑血管病的发生发展及其预后有密切关联，是缺血性脑血管病发生的危险因素之一［1-2］。血浆胆固醇升高与冠状动脉及外周血管疾病的发病率升高有关联，而动脉粥样硬化病变的发生也增加了组织发生缺血的可能性。同时，早在动脉粥样硬化病变出现之前，高胆固醇血症就会导致微血管功能障碍。研究［3-4］显示：高胆固醇饮食引起的血脂紊乱导致脑微血管发生氧化应激损伤，并促使微血管出现炎性表现以及有利于血栓形成的表型，表现为微血管内皮细胞黏附分子表达增加，白细胞与内皮细胞黏附增强。本课题组前期研究［5］结果也表明：血浆胆固醇水平升高时，脑微血管抗氧化能力明显降低，进而引起微循环功能障碍。高胆固醇血症造成的脑微循环障碍，使脑组织更易发生缺血损伤，并且当脑缺血发生时，损伤会更加严重。

姜黄素是从姜黄根部提取的一种天然活性酚类化合物，具有降低胆固醇、抗氧化和抗炎等多种药理作用［6-8］。作为一种有潜在治疗意义的特效前体药物，姜黄素一直是药物研发领域关注的热点。但是姜黄素是否能够基于降低血浆胆固醇而改善高胆固醇血症模型大鼠脑部微循环障碍目前尚不清楚。为了探索姜黄素对脑部微循环的保护作用，本研究以高胆固醇饲料喂饲大鼠制备高胆固醇血症大鼠模型，同时灌胃给予姜黄素，观察姜黄素对大鼠血脂水平的影响以及对脑部微血管氧化应激损伤及细胞黏附分子表达的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器雄性Sprague Dawley（SD） 大鼠30 只，体质量（180±20） g，SPF 级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物使用许可证号：SYXK11-00-0008。饲养条件：室温（22±1）℃，相对湿度60%，光线自动控制12 h 明暗交替变换。大鼠自由摄取水和食物。

姜黄素（含量95.5%） 购自河北食品添加剂有限公司（生产批号：090630），葡聚糖T-40（Dextran T-40，17-0270-01） 购自美国Pharmacia公司，羧甲基纤维素钠购自北京凤礼精求商贸有限责任公司（批号：1812250），丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 检测试剂盒购自南京建成科技有限公司，细胞间黏附因子1 （intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）羊抗大鼠多克隆一抗、血管细胞黏附因子1 （vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1） 兔抗大鼠多克隆一抗和E-选择素（E-selectin） 羊抗大鼠多克隆一抗购自美国Santa Cruz 公司，总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白 胆 固 醇（high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C） 和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C） 试 剂 盒 由 首 都 医科大学临床科技中心提供。全自动生化分析仪（Beckman Coulter CX4 Pro，美国Beckman 公司），全自动酶标仪（LP4000 型，法国巴德斯公司），PowerPac200 电泳仪和电泳湿转仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 高胆固醇血症大鼠模型的构建30 只SD 大鼠适应性喂养7 d 后，随机分为对照组、模型组和姜黄素组，每组10 只。对照组大鼠每日给予普通饲料，其余2 组大鼠每日给予高胆固醇饲料，各组大鼠自由饮水，连续喂饲28 d。姜黄素用1%羧甲基纤维素钠配成混悬液。造模同时各组大鼠灌胃给药，每日1 次，对照组和模型组大鼠给予等量1%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，姜黄素组大鼠给予姜黄素200 mg·kg－1灌胃。高胆固醇饲料由2%胆固醇、0.2%胆酸、10%猪油、15%蛋黄粉和72.8%基础饲料组成，购自中国医学科学院实验动物中心。

1.3 取材及样品制备实验结束后，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用颈总动脉插管取血（取血前10 h 禁食水），待血液自凝后，取血清，－20 ℃保存，检测血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C 水平。断头处死大鼠，迅速取大鼠大脑皮层，称质量，切成1 mm×1 mm×1 mm 小块，放于杜恩斯玻璃匀浆器中，加入3 倍体积PBS（0.01 mol·L－1，pH 值 为7.4），匀 浆，取 出 匀 浆液，4 ℃、1 000 g 离心10 min，取沉淀，在3 倍体积的PBS 缓冲液中重悬，放入15%葡聚糖溶液，4 ℃、4 500 g 离心20 min，取出沉淀，放于50 μm的尼龙网筛，用冰PBS 缓冲液冲洗过滤，收集脑血管组织，－80 ℃条件下冻存，用于检测脑微血管组织中SOD 活性和MDA 水平以及微血管内皮细胞 中ICAM-1、 VCAM-1 和E-selectin 蛋 白 表 达水平。

1.4 大鼠血清中血脂水平检测采用全自动生化仪用酶法检测各组大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C 水平。

1.5 大鼠脑微血管组织中SOD 活性和MDA 水平检测按照试剂盒说明书中的检测程序严格操作。采用黄嘌呤氧化酶法检测大鼠脑微血管组织中SOD 活性，采用硫代巴比妥酸法（TBA 法）检测大鼠脑微血管组织中MDA 水平。

1.6Western blotting 法检测大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋 白 表 达 水平提取脑微血管总蛋白，用BCA 法调定各组蛋白浓度，溶解于10 g·L－1十二烷基硫酸钠（SDS）中，沸水浴变性后，每组样品取等量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转移至硝酸纤维素膜上，将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中，室温下封闭2 h。加入一抗和β-actin，4 ℃过夜。洗膜后，加入相应二抗（1∶1 000） 中，室温反应2 h，再次洗膜，加入ECL 化学发光液。使用Image J 凝胶成像分析系统检测各蛋白条带，对各条带整合灰度进行分析，实验重复3 次，取平均值。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值／β-actin 条带灰度值。

1.7 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠血脂水平，大鼠脑微血管组织中SOD 活性和MDA 水平，大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表达水平，经正态性检验符合正态分布，均以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血脂水平与对照组比较，模型组大鼠血清中TC、 TG 和LDL-C 水平明显升高（P＜0.01），HDL-C 水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，姜黄素组大鼠血清中TC、TG 和LDL-C 水平明显降低（P＜0.05），HDL-C 水平明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血脂水平Tab.1 Levels of blood lipids of rats in various groups

2.2 各组大鼠脑微血管组织中SOD活性和MDA水平与对照组比较，模型组大鼠脑微血管组织中SOD 活性明显降低（P＜0.01），MDA 水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，姜黄素组大鼠脑微血管组织中SOD 活性明显升高（P＜0.05），MDA 水平明显降低（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表达水平与对照组比较，模型组大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，姜黄素组大鼠脑微血管内皮 细 胞 中 ICAM-1 、 VCAM-1 和E-selectin 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图1 和表3。

表2 各组大鼠脑微血管组织中SOD 活性和MDA 水平Tab. 2 Activities of SOD and levels of MDA in cerebral microvessel tissue of rats in various groups (n=10，）

表2 各组大鼠脑微血管组织中SOD 活性和MDA 水平Tab. 2 Activities of SOD and levels of MDA in cerebral microvessel tissue of rats in various groups (n=10，）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model Curcumin SOD[λB/（U·mg－1）]93.04±8.41 129.88±9.47**99.82±7.96△MDA[mB/（μmol·g－1）]9.09±0.98 12.69±1.12*9.58±1.07△

图1 各组大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin 蛋白表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of ICAM-1，VCAM-1 and E-selectin proteins in cerebral microvessel endothelial cells of rats in various groups

表3 各组大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of ICAM-1 ，VCAM-1 and E-selectin in cerebral microvessel endothelial cells of rats in various groups

表3 各组大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1 和E-selectin 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of ICAM-1 ，VCAM-1 and E-selectin in cerebral microvessel endothelial cells of rats in various groups

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model Curcumin ICAM-1 0.10±0.02 0.41±0.04**0.23±0.02Δ VCAM-1 0.30±0.04 0.70±0.08*0.50±0.07△E-selectin 0.67±0.03 0.93±0.05**0.78±0.04△

3 讨 论

本研究结果显示：高胆固醇饮食大鼠可出现高胆固醇血症，血浆胆固醇水平升高使脑微血管抗氧化应激能力减弱，脂质过氧化物生成增多，内皮细胞表面的黏附因子表达水平升高；姜黄素可以明显降低高胆固醇血症大鼠血脂水平，提高大鼠脑微血管组织中SOD 活性并降低MDA 水平，同时降低大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、 VCAM-1 和E-selectin 表达水平。本研究结果提示：姜黄素对高胆固醇饮食造成的早期大鼠脑微循环氧化应激及炎性改变具有保护作用。

高胆固醇血症作为一种病理状态，参与诸多与炎症和血栓形成相关的疾病，是重要的致病机制之一［9-10］。高胆固醇血症引起的微血管功能障碍表现为微动脉内皮依赖性血管舒张功能受损，毛细血管后微静脉白细胞和血小板聚集，并且在微动脉和微静脉均出现氧化应激损伤［10］。研究［11］表明：血浆胆固醇升高导致脑微血管内白细胞和血小板大量募集的机制可能与活性氧簇的产生有关。缺乏还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 氧化酶亚单位gp91phox 的高胆固醇血症小鼠血小板和白细胞募集反应明显减弱。同时，NADPH 氧化酶激活产生的超氧化物可促进内皮细胞黏附因子表达的增加。在高脂环境下，细胞黏附依赖性信号通路参与高胆固醇血症时微血管改变，大量的黏附因子被激活。血管内皮细胞表面表达的ICAM-1、VCAM-1和E-selectin 表达上调，使白细胞在激活的内皮细胞表面滚动速度变慢，并且黏附的更加紧密，参与炎症早期的黏附瀑布级联反应［4］。本研究中，高胆固醇饮食诱导大鼠脑微循环出现氧化应激损伤及炎性改变，与上述研究结果一致。

姜黄素通过调节大量分子靶标，对多种慢性疾病起到预防和治疗作用，且姜黄素的安全性、有效性和经济性也是其优于其他化合物的显著特点［12-13］。作为一种前体药物，姜黄素可以通过在靶点释放有活性的自由巯基而实现抗氧化和抗炎的作用。结合姜黄素诸多优势，本研究选用姜黄素对缺血性脑卒中的危险因素进行干预，期望通过调控危险因素，预防缺血性脑卒中发生，与以往实验研究［14-16］一致，姜黄素能够起到调节血脂水平，降低胆固醇的作用。同时，本研究结果显示：姜黄素可以明显减轻高胆固醇血症大鼠脑微循环氧化应激损伤，抑制脑微循环内皮细胞黏附因子表达。研究［3］显示：胆固醇升高到一定阈值，微循环才会出现诸如黏附因子表达增多和血细胞黏附性增强等血管炎性改变；胆固醇水平一旦低于阈值，血管炎症反应就会消失。因此推测，姜黄素改善大鼠脑微循环障碍的作用与其降低胆固醇的作用有关联，由于胆固醇水平的降低，大鼠脑微循环氧化应激反应及黏附因子表达降低。

大量的临床前研究为评价姜黄素在临床试验中的疗效奠定了坚实的基础。目前，100 多个姜黄素临床试验正在进行，将有助于更加充分地了解姜黄素的治疗潜力及其在人类各种疾病临床治疗中的应用前景［17］。但是作为极有研发潜力的药物，姜黄素的临床应用也受到一定程度的限制，与其吸收不良、代谢迅速、生物半衰期短和口服生物利用度低的性质有关［18］。也有研究［19］表明：姜黄素可上调肠道碱性磷酸酶（肠上皮细胞产生的内源性成分）的表达，进而通过抗氧化和抗炎途径来发挥远端的或间接的保护作用。为了提高姜黄素的生物利用度，许多研究致力于研发诸如胡椒碱等生物佐剂与姜黄素联合应用，或开发姜黄素结构类似物，或研发诸如姜黄素纳米颗粒等药物递送技术。随着生物利用度的提高，姜黄素会在慢性疾病治疗中发挥巨大作用［20-23］。

综上所述，姜黄素可以通过下调高胆固醇饮食引起的高胆固醇血症大鼠血脂水平，提升大鼠脑微血管抗氧化应激能力，减轻氧化应激损伤，减少内皮细胞黏附因子表达，对高胆固醇饮食造成的早期的大鼠脑微循环氧化应激及炎性改变具有保护作用。针对高胆固醇血症这种危险因素，姜黄素可以通过其降脂特性，改善血管内皮功能，预防缺血性脑卒中的发生。基于姜黄素在高胆固醇血症大鼠脑微循环水平表现出的抗氧化抗炎作用，本研究将为动脉粥样硬化及其相关疾病的预防提供实验依据。