辣椒miR169及其靶基因的生物信息学分析

刘雪梅，王悦，李玮琦，魏继承，任如意，郝爱平

摘要：为了解miR169基因家族在辣椒生长发育过程的重要调控作用，通过生物信息学的方法对can-miR169基因家族的成员进行了染色体定位、序列保守性分析、系统发育进化树分析、前体序列二级结构预测和靶基因预测。结果表明：can-miR169家族成员定位在4条染色体上;成熟序列高度保守，前体序列在产生成熟序列的位置高度保守;预测结果显示can-miR169家族成员均有靶基因，这些靶基因主要以靶基因核因子A（NF-YA）复合物为主，且大体相同。这些靶基因可以参与到种子萌发、植株发育和对外界环境胁迫的应答等多种生命活动中。

关键词：miR169;辣椒;生物信息学;NF-YA

中图分类号：S641.3文献标识码：A文章编号：1000-4440（2021）06-1510-06

Bioinformatics analysis of miR169 and its target genes in pepper

LIU Xue-mei，WANG Yue，LI Wei-qi，WEI Ji-cheng，REN Ru-yi，HAO Ai-ping

（ College of Life Sciences and Technology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157011， China）

Abstract： In order to understand the important regulatory role of miR169 gene family in the growth and development of pepper， the members of can-miR169 gene family were analyzed by bioinformatics， including chromosome mapping， sequence conservation analysis， phylogenetic tree analysis， precursor sequence secondary structure prediction and target gene prediction. The results showed that the members of can-miR169 family were located on four chromosomes， the mature sequence was highly conserved. The precursor sequence was highly conserved in the position where the mature sequence was produced. The forecasting results indicated that all members of can-miR169 family had target genes， which were mainly composed of nuclear factor Y （NF-YA） complexes and were roughly the same. These target genes can be involved in a variety of life activities such as seed germination， plant development and response to external environmental stress.

Key words：miR169;pepper;bioinformatics;NF-YA

MicroRNA（miRNA）是真核生物体中内生的，长度大致为20～24个核苷酸[1]，具有一定的保守性、时序性和结构特异性的非编码小分子RNA。miRNA调控植物的生长发育、信号转导和对外界环境非生物胁迫的响应等生命活动[2]。一个miRNA可能具有一个或多个靶基因，且miRNA一般都是通过对靶基因的切割和翻译抑制[3]对靶基因进行调控。

从目前的研究结果来看，miRNA家族庞大且调控方式复杂，其中，miR169是植物miRNA中几个最大的miRNA家族之一，仅水稻miR169家族就登记了十几个家族成员，且成员间具有大体相同的成熟序列和靶基因。近年，越来越多的科研人员研究了miR169对植物的逆境调控作用。Li等[4]发现miR169可在水稻抗稻瘟病中起负调节作用。陈禹彤等[5]发现miR169o可以参与干旱胁迫的应答。舒李露等[6]发现当miR169过表达时能够促进山核桃植株提前开花。阮先乐等[7]发现油菜miR169可以参与到非生物胁迫的应答中。而董云等[8]进一步研究发现油菜miR169d也可以通过对靶基因的调控实现早花。方辉等[9]发现葡萄miR169是重要的生长发育和逆境胁迫的调控元件。Sorin等[10]发现拟南芥miR169通过调节靶基因核因子A（NF-YA）来直接或间接地参与到植物对环境信号的应答中。Serivichyaswat等[11]发现拟南芥miR169可以对外界温度的影响进行负调控。Hanemian等[12]发现在拟南芥抗青枯病突变体中miR169表现为负调控，miR169的过表达则使突变株失去抗性。Yu等 [13]发现在大豆中gma-miR169c通过抑制其靶基因NF-YA复合物的表达来对大豆干旱胁迫的应答起负调控作用，是一种应对干旱胁迫的候选miRNA。Zhang等[14]发现在番茄中sly-miR169c的过表达增强了番茄的耐旱性。

在以往的研究中，NF-YA转录因子在不同植物中的作用也被一点点地挖掘出来。Marcoantonio等[15]研究发现NF-YA过表达可以延缓某种因胁迫造成的植物衰老。NF-YA可以抑制一些包括早期ABA介導的基因表达，还可以通过降低植物的生长速率来实现对非生物胁迫的调控，而且一般含有NF-YA复合物的植物对外界环境胁迫所诱导的植物衰老具有一定的耐受性。Ni等[16]发现在大豆中NF-YA与抗旱息息相关，NF-YA可以通过增强大豆对高盐度和外源ABA的敏感性来发挥自己在正调控植物抗旱性的重要作用。

辣椒在中国是一种十分重要的蔬菜作物，能够带来很大的经济效益，但是产量易受环境因素的影响[17-19]。环境胁迫已成为制约农业发展的主要限制因子，发掘利用植物自身的抗逆境能力， 选育优良品种已成为重要课题[20]。辣椒miR169（can-miR169）家族之中成员较多且在辣椒的生长过程中可能具有复杂的调控关系，但具体的作用机理以及调控机制尚未知道。本研究将利用Phytozome等数据库以及多种在线软件对can-miR169基因家族的序列分布、染色体定位特征、二级结构、发育进化树以及靶基因的调控机理进行一定的生物信息学分析，以期明确can-miR169在辣椒生长过程中的调控作用，为辣椒抗逆性研究以及优秀品种选育等提供参考数据。

1材料与方法

1.1数据来源

在miRNA数据库PmiREN（http：//www.pmiren.com/）中直接搜索can-miR169数据，并通过下载的方式获得can-miR169家族的全部15名成员的成熟序列。

1.2染色体定位

将can-miR169家族全部成员的前体序列以FASTA格式提交至数据库PEPPER GENOME（http：//peppergenome.snu.ac.kr/）中通过在线比对的方式获得染色体定位信息，其中参数设置均为默认值。

1.3前体序列二级结构预测

将can-miR169的前体序列以FASTA格式提交至RNAfoldWebServer（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）中，预测can-miR169基因家族的全部成员的前体二级结构，其中參数均为默认。

1.4序列比对分析与系统发育进化树分析

利用Multiple Sequence Alignment（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）和ESPript3.X（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）对can-miR169的成熟序列进行多序列比对，结果利用WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）绘制序列保守性图片。Logo图可以显示出序列中每个位置上碱基出现的频率以及序列保守程度。其中参数均为默认值。利用MEGA X通过邻近法（Neighbor-Joining method）绘制can-miR169基因家族的系统发育进化树，其中Bootstrap设置为1 000次，其余参数均为默认值。

1.5靶基因预测

利用PmiREN（http：//www.pmiren.com/）和WMD3（http：//wmd3.weigelworld.org/cgi）的在线预测获得can-miR169家族成员的靶基因预测信息，结果再通过利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Nucleotide数据库以及BLAST的在线比对进行靶基因的功能注释。

2结果与分析

2.1can-miR169家族成熟序列分析及其基因定位结果

利用PmiREN数据库搜索到15个can-miR169基因家族成员（表1），结果显示除can-miR169c和can-miR169g的长度为22个碱基外其余13个成员的长度均为21个碱基。利用数据库PEPPER GENOME对全部15个成员进行定位，结果显示15个基因序列分布在4条染色体上，分别为染色体2、染色体4、染色体7、染色体8。其中有8个成员位于染色体7上，分别为can-miR169a、can-miR169b、 can-miR169e、 can-miR169f 、can-miR169g、 can-miR169j、can-miR169k、 can-miR169l，有5个成员位于染色体8上，分别为can-miR169d、can-miR169h、can-miR169m、can-miR169n、can-miR169o，其余2个成员中can-miR169c位于染色体2上，can-miR169i位于染色体4上。

2.2can-miR169家族成员成熟序列的保守性分析

利用Multiple Sequence Alignment和ESPript 3.X对can-miR169家族成员成熟序列及前体序列进行保守性分析（图1），并利用WebLogo对结果绘制了更为直观的序列保守性对比图（图2）。由图1和图2可以看出can-miR169家族成熟序列中18个碱基完全保守，另有2个碱基高度保守，其余碱基保守性较低甚至不保守，而且can-miR169a、can-miR169b、can-miR169i、can-miR169j、can-miR169k、can-miR169l、can-miRm、can-miR169n、can-miR169o和can-miRd、can-miRe、can-miRf成熟序列碱基完全相同。前体序列高度保守区域几乎与成熟序列完全重合，而前体序列其余位置保守性差应可能是其处于不同发育阶段不同的植物组织中造成的。

2.3can-miR169基因家族前体序列二级结构预测

利用在线软件RNAfoldWebServer对can-miR169基因家族前体序列进行二级结构预测。结果显示can-miR169基因家族成员均能形成稳定的茎环架构。在这些家族成员中，其结构特点与Luan等[21]研究结果相同，can-miR169二级茎环结构高度可变，高度保守结构均位于茎区，其他区域在大小和茎环结构差异很大。挑选出几个较为典型的二级结构预测图（can-miR169a、can-miR169g、can-miR169k、can-miR169n二级结构预测图）作为展示（图3）。

2.4can-miR169家族前体序列的系统发育进化树分析

利用MEGA X对can-miR169基因家族的前体序列进行比对分析并绘制系统发育进化树。结果显示，前体序列进化树（图4）显示，can-miR169 15个成员除can-miR169o、can-miR169c外，共分为3个分支：can-miR169d、can-miR169h、can-miR169m、can-miR169n（分支Ⅰ），can-miR169a、can-miR169b、can-miR169l、can-miR169i（第Ⅱ分支），can-miR169e、can-miR169g、can-miR169f、can-miR169j、can-miR169k（分支Ⅲ）。从进化树上看，can-miar169o、can-miR169c应比其他成员产生早，两者序列差异也较其他序列大。与此同时参考了miRNA数据库PmiREN中成熟序列表达位置和RPM值信息，大部分can-miR169成员的主要表达位置为植物的根和茎，只有can-miR169c在植物根、茎、叶、花、果实中极少量表达。结合进化树，可解释can-miR19c成熟序列与其他成熟序列差异最大。因此推测can-miR169基因在其进化过程中发生了较多碱基突变、替换等现象，或者其进化过程更为复杂，这与蒋梦琦等[22]关于miR156家族的序列分析结果类似，即不同成员由于不同时间不同速度进化或所处于植物体不同的组织中从而导致前体序列差异较大，同时也证明了其在进化过程中功能区的保守性。

2.5can-miR169家族靶基因预测

利用数据库PmiREN和在线软件WMD3的初步预测以及NCBI的BLAST在线比对，获得了一个较为准确的can-miR169靶基因預测结果（表2）。结果显示，除can-miR169g外，其余成员均具有多个靶基因且大多数都为NF-YA转录因子基因，说明NF-YA转录因子基因是can-miR169家族的重要靶基因。这些靶基因编码产物中包含了多种转录因子和多种蛋白质，说明miR169参与调控了辣椒的多种生命活动，参与了辣椒的多种代谢活动。这为以后can-miR169-NF-YA非生物胁迫代谢途径研究提供了理论基础。

3讨论

到目前为止，科研工作者已经从35种植物中发现了超400个miR169基因家族成员[23-24]。本研究利用生物信息学方法对can-miR169基因家族的成熟序列和前体序列进行了保守性分析、系统发育进化树分析、二级结构预测和靶基因预测，至此我们对can-miR169基因家族有了初步的了解。本研究结果显示，can-miR169基因家族共有15个家族成员，且这15个家族成员在成熟序列中保守性较高，在前体序列中位于成熟序列产生位置的碱基保守性较高。通过对can-miR169基因家族前体序列的系统发育进化树的分析可以看出，前体序列在进化过程中因处于不同植物组织在不同时间以不同的速率发生碱基突变和缺失从而产生了除茎区外几乎不具保守区的特点。

通过对靶基因的预测不难看出can-miR169家族成员除can-miR169g外都具有多个靶基因并且这些靶基因大体相同。这不仅表明在辣椒中miR169家族参与了多种生命活动的调控，也表明了在辣椒中miR169家族具有大体相同的调控作用。在can-miR169家族众多的靶基因中，大多数为NF-YA转录因子基因，这说明NF-YA转录因子基因是can-miR169家族的主要靶基因。徐妙云等 [25]发现在玉米中NF-YA能提高玉米对外界胁迫的耐受性。NF-YA通过调控根系来作为对外界干旱、高盐等非生物胁迫的应答，提高玉米对外界环境胁迫的耐受性。Zhao等[26]发现在水稻中NF-Y复合物可以起到一定的抗旱作用，在对水稻miR169家族成员进行高盐诱导的研究中发现大量NF-Y亚基在干旱条件下受到抑制，说明调控NF-Y复合物的某些基因表达被关闭，进而说明NF-Y复合物在植物抗旱中发挥重要作用。Li等[27]研究发现NF-YA5同样在植物抗旱方面可以起到作用，NF-YA5可以通过在植物保卫细胞中的表达或者对气孔大小的调控来实现对植物抗旱性的调控，另外这也证明NF-YA复合物在植物抗旱性方面的调控作用是必不可少的。辣椒每年受干旱影响造成产量减少的情况频发，通过对can-miR169基因家族的生物信息学分析，可以为辣椒抗旱优良品种的选育与性状改良提供思路和理论基础。

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（责任编辑：张震林）

收稿日期：2021-04-20

基金项目：牡丹江师范学院科研项目（YB2020005）;黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目（1353MSYYB011）

作者简介：刘雪梅（1996-）女，贵州黔东南人，硕士，研究方向为分子生物学与生物化学。（E-mail）lxm12252021@163.com

通讯作者：郝爱平，（E-mail）swxhap@126.com