熟地黄、枸杞子及其混合提取物对小鼠视网膜光损伤的保护作用△

王雪纯 张伟 郭雅图 巩一博

年龄相关性黄斑变性(AMD)已成为全球第三大常见致盲性眼病，也是发达国家老年人不可逆转失明的最常见原因。熟地黄和枸杞子都是我国使用广泛的中草药，具有明目的功效，且早已有研究证明两者均具有抑制氧化应激和细胞凋亡的特性[1-7]。AMD主要损伤机制为视网膜细胞的氧化应激作用导致细胞凋亡[8]，视网膜光损伤的病理过程与其相似，因此本研究通过建立小鼠光损伤模型模拟AMD视网膜病变[9]，探究熟地黄、枸杞子提取物以及两种药物混合提取物对光损伤造成的AMD模型小鼠视网膜功能和结构的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，TUNEL法荧光试剂盒(美仑生物技术有限公司)，熟地黄提取物、枸杞子提取物及二者混合提取物(天津科技大学提供)，LED灯(深圳市爱图仕影像器材有限公司)，罗兰电生理仪(德国罗兰公司)，Phoenix Micron IV小动物视网膜成像仪(美国Phoenix Research Labs公司)。

1.2 实验动物与分组本实验采用34只C57BL/6野生型小鼠(斯贝福生物技术有限公司)，8周龄，雄性，体质量约20 g，随机分为对照组(8只)、模型组(8只)、熟地黄组(6只)、枸杞子组(6只)、熟地黄+枸杞子组(6只)；各药物干预组连续灌胃9周，根据《中华人民共和国药典》2015版，熟地黄、枸杞子分别用水提法浓缩烘干后，粉碎成粉末，生理盐水混悬灌胃，药物剂量分别为：熟地黄0.45 g·kg-1·d-1，枸杞子0.46 g·kg-1·d-1，剂量及配伍均对实验动物无害[10-11]。灌胃期间，各组小鼠在昏暗的循环光(5 lux，12 h开/关)下，保持良好通风，温度维持在22 ℃，灌胃第9周开始进行造模[3,12]。本研究遵循《实验动物管理条例》(2017修订版)的规定。

1.3 视网膜光损伤模型的建立预先将模型组、熟地黄组、枸杞子组、熟地黄+枸杞子组小鼠放在有透明隔板的透明塑料箱中，每只小鼠单独放置，避免受损不均，装置上方通风良好，将强度为(10 000±500)lux的白光光源放置在光照箱上方30 cm。散瞳后连续光照7 d，每天光照4 h。7 d光损伤结束后对小鼠视网膜进行各项功能及形态学检查。

1.4 视网膜电图检测小鼠视网膜功能各组小鼠暗反应12 h后进行视网膜电图(ERG)检查。各组小鼠给予异氟烷吸入麻醉，散瞳后将其固定于动物台上，连接参考电极于头部，环形角膜刺激电极固定于眼球角巩膜缘处，地极接于尾根部，应用罗兰视网膜电生理仪，记录暗反应下光强度0.01 cds·m-2、3.00 cds·m-2、10.00 cds·m-2及震荡电位(OPS)波形，并对波幅进行统计学分析。

1.5 光学相干断层扫描检测小鼠视网膜各层厚度各组小鼠给予异氟烷吸入麻醉，散瞳后双眼涂卡波姆眼用凝胶保护角膜，瞳孔散大后应用Phoenix Micron IV小动物视网膜成像仪，活体观察视网膜各层形态，光学相干断层扫描(OCT)检测小鼠视网膜各层厚度，判断其是否存在视网膜结构损伤。

1.6 荧光素眼底血管造影检查眼底血管渗漏情况OCT检查结束后，小鼠保持原位，20 g·L-1荧光素钠腹腔注射，同样应用Phoenix Micron IV小动物视网膜成像仪观察视网膜血管的充盈状态及渗漏情况，Angio Tool软件分析动静脉期小血管密度等参数。

1.7 视网膜病理切片观察活体检测结束后，小鼠吸入适量异氟烷麻醉，取出完整眼球置于眼球固定液中，12 h后切除眼球标本上部分角膜，再固定8 h后，标本进行脱水、包埋、切片，行HE染色及TUNEL免疫荧光和DAPI染色。光学显微镜下观察各组视网膜各层结构及凋亡细胞情况，包括视网膜神经节细胞层(GCL)、内核层(INL)、外核层(ONL)，通过Image J软件进行细胞计数，计算细胞凋亡率。

1.8 血液生物化学检测抗氧化能力小鼠予异氟烷吸入麻醉活体取出眼球后，收集1 mL滴落的眼动脉血液后，立即颈椎脱臼法处死小鼠。测定血清中其SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)四项指标。

1.9 统计学分析采用SPSS 24.0统计学软件处理数据。数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，再采用LSD法进行两组间比较。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 光损伤模型制作利用光损伤模式模拟AMD视网膜病变，在ERG中，暗反应下光强度0.01 cds·m-2、3.00 cds·m-2时模型组b波波幅较对照组分别降低了25.6%、37.3%，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。模型组眼底照相中可见视网膜色素上皮(RPE)层光损伤后变性，OCT图像中可见对应位置Bruch膜物质沉积。病理切片HE染色中模型组ONL细胞明显有紊乱、密度降低的趋势，GCL细胞显著减少，RPE层呈现萎缩样改变。TUNEL染色中模型组视网膜总细胞凋亡率和ONL层细胞凋亡率均较对照组显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。以上结果证明强光照射导致小鼠视网膜功能及结构损伤。

2.2 熟地黄、枸杞子提取物能改善光损伤小鼠的视网膜功能暗反应下0.01 cds·m-2b波、3.00 cds·m-2b波、10.0 cds·m-2b波波幅在模型组与对照组、各药物干预组之间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。0.01 cds·m-2暗反应下，枸杞子组、熟地黄+枸杞子组b波和OPS波波幅较模型组均显著提高；3.00 cds·m-2、10.00 cds·m-2暗反应下枸杞子组、熟地黄+枸杞子组的b波较模型组均显著提高；以上差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。此外，暗反应下熟地黄+枸杞子组的0.01 cds·m-2b波、3.00 cds·m-2b波和OPS波波幅均较熟地黄组显著提高(均为P<0.05)。3.00 cds·m-2、10.00 cds·m-2暗反应下对照组、各药物干预组a波均较模型组升高,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。(见图1、表1)。

图1 各组ERG波形及波幅 A：各组小鼠ERG暗反应下光强度为0.01 cds·m-2 和3.00 cds·m-2 时b波波形；B：各组小鼠ERG暗反应下不同刺激光强度下b波波幅

表1 暗反应下不同背景光强度时各组小鼠ERG波幅

2.3 熟地黄、枸杞子提取物可改善光损伤小鼠视网膜结构损伤在模型组小鼠的眼底照相和OCT图像中观察到典型的早期AMD特征性表现，如视网膜渗出样改变和玻璃膜疣样病变，阳性率为57.0%；在熟地黄组中观察到相同病变，阳性率为12.5%；而对照组、枸杞子组、熟地黄+枸杞子组中未观察到此病变(见图2)。HE染色中模型组ONL结构有明显紊乱、细胞密度降低的趋势，RGC细胞显著减少，GCL呈现萎缩样改变；对照组、熟地黄组、枸杞子组、熟地黄+枸杞子组视网膜各层结构排列规整，细胞形态均一，RPE层连续整齐。可见熟地黄、枸杞子可抑制光损伤导致的视网膜ONL变薄(见图3)。

图2 各组小鼠眼底照相和OCT图像 红色箭头示视网膜渗出样改变和玻璃膜疣样病变。

图3 各组小鼠视网膜病理切片HE染色(×40)

2.4 光损伤未导致小鼠视网膜血管损伤渗漏运用血管分析软件Angio Tool进行分析后发现，各组小鼠视网膜血管面积和分支数量差异均无统计学意义(均为P>0.05)，模型组视网膜受损部位未见荧光素渗漏(见表2、图4)。

图4 各组小鼠FFA图像

表2 各组小鼠视网膜血管面积和分支数量

2.5 熟地黄、枸杞子提取物可降低光损伤小鼠视网膜细胞凋亡率Image J软件进行细胞计数，模型组视网膜全层、GCL、INL、ONL细胞凋亡率均较对照组显著升高，熟地黄组、枸杞子组、熟地黄+枸杞子组视网膜全层、GCL、INL、ONL细胞凋亡率均较模型组显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见图5、表3)。

表3 各组小鼠视网膜TUNEL免疫荧光染色检测细胞凋亡率

图5 各组小鼠TUNEL免疫荧光染色和DAPI染色(×20)

2.6 熟地黄、枸杞子提取物可提高光损伤小鼠血清抗氧化能力熟地黄组、枸杞子组和熟地黄+枸杞子组中SOD活性较模型组分别升高了8.93%、16.30%、20.57%，且熟地黄+枸杞子组较熟地黄组升高了11.40%；熟地黄组、枸杞子组、熟地黄+枸杞子组中GSH-Px活性较模型组分别升高了14.44%、20.05%、36.04%，熟地黄+枸杞子组较熟地黄组、枸杞子组分别升高了14.90%、13.40%；熟地黄+枸杞子组中MDA含量较模型组降低了7.60%；以上差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表4)。

表4 各组间SOD、GSH-Px活性及MDA含量比较

3 讨论

视网膜是感受和传递视觉信息的起始部位，是人体中耗氧量最高的组织之一，容易受到强光的影响而造成视觉功能障碍，光诱导的视网膜损伤以光感受器细胞凋亡、RPE层损伤为特征[13]。AMD是一种视网膜退行性疾病，大量研究证实，衰老、吸烟及持续可见光暴露与AMD的发生密切相关[14-16]。光暴露是视网膜氧化应激、细胞凋亡的重要因素[8-9,17-18]。小鼠模型和人类AMD发病基本病理改变类似[19]，且小鼠视网膜与人类周边视网膜结构大致相同，因此，本研究利用光损伤诱导C57BL/6小鼠视网膜病变模拟AMD视网膜病变[2，9]。

ERG主要用于视网膜功能的分析，其中a波主要来源于视网膜光感受器细胞电位；b波幅度较大，主要与视网膜双极细胞的电活动有关[20]。熟地黄和枸杞子干预显著缓解了光损伤造成的功能下降。熟地黄+枸杞子联合给药效果更为显著，比单独应用熟地黄效果更优。对于视网膜结构的改变，模型组的眼底照相和OCT检查结果符合AMD早期病变[21]，但对照组、说明熟地黄组、枸杞子组、熟地黄+枸杞子组没有出现类似改变，熟地黄、枸杞子能够缓解光损伤造成的视网膜结构改变。荧光素钠能在蓝色光激发下透过较薄的血管壁呈现绿色荧光，FFA即可显示视网膜上血管管径和形态。模型组2～4 mm小血管面积和血管分支数无显著增多，可能原因为本研究造模中光照损伤时间较短，只造成了急性损伤，形成早期AMD病变，新生血管未形成，未出现渗出样改变[22-25]。其中氧化应激是AMD发展的核心，有研究显示，全身氧化应激与视网膜氧化应激均与AMD相关[26-27]，特征为组织中活性氧(ROS)水平升高，导致细胞中蛋白质、脂质和DNA受损或修饰，使细胞中Caspase-3、Bax mRNA等表达降低，Bcl-2 mRNA表达升高，降低细胞生理作用，导致细胞凋亡[22,24,28-30]。在HE染色中，模型组ONL即光感受器细胞核层数明显减少，细胞间隙增大、排列紊乱，TUNEL染色结果同样显示模型组ONL细胞凋亡率明显升高；RPE层可见驼峰样隆起，为RPE细胞代谢障碍产生的异常代谢产物在视网膜上的异常沉积，此为早期AMD的特征性病变，与OCT中病变部位图像相对应，证明RPE结构的破坏[31]。各药物干预组与对照组的视网膜各层细胞排列紧密整齐，RPE层结构完整。

有文献证明[32-33]，视紫红质、类视黄醇会吸收过量光子，进而生成大量氧自由基，细胞膜性结构中的脂类发生过氧化连锁反应，形成过多脂质过氧化物(如MDA)在组织内积累，致使视锥细胞发生氧化应激损伤，本研究结果也证实，光照损伤使小鼠血清MDA含量明显升高。熟地黄和枸杞子提取物中的多种活性物质已被证实具有抗氧化、抗凋亡等作用[34]；枸杞多糖可防止脂质过氧化，通过检测多种主要内源性抗氧化标志物的改变得到证实[1,35-36]；枸杞子中的β-类胡萝卜素类物质是有效的自由基清除剂，叶黄素对视网膜的保护机制主要为滤过蓝光和抗氧化损伤[4]。在TUNEL染色中，熟地黄、枸杞子提取物显著降低视网膜各层细胞凋亡率，具有延缓细胞凋亡的作用，维持视网膜结构完整，熟地黄+枸杞子共同干预对视网膜细胞凋亡抑制作用更强。熟地黄和枸杞子有提高抗氧化能力并降低血清MDA的趋势，熟地黄+枸杞子组趋势更为显著，说明熟地黄、枸杞子可通过增强SOD、GSH-Px活性及降低MDA含量提高全身抗氧化能力，降低视网膜氧化应激损伤，抑制组织中产生大量的ROS所导致碳水化合物、膜中脂质、蛋白质和核酸的修饰和破坏，从而延缓细胞凋亡。

本研究结果表明,熟地黄和枸杞子可对光诱导的视网膜损伤有保护作用，维持视网膜功能，保护视网膜结构完整性，通过提高全身抗氧化能力降低氧化应激损伤，延缓视网膜各层细胞的凋亡，且两种药物同时服用预防趋势更加明显。熟地黄和枸杞子是我国产量丰富、价格低廉的中草药，老年人适量服用这两种中药有助于预防AMD发生，提高全身抗氧化能力。熟地黄和枸杞子对视网膜损伤保护作用的分子机制尚未完全明了，有待深入研究探讨。