lncRNA MALAT1靶向调控miR-214在睾丸缺血再灌注损伤中的作用及其机制

宁金卓，卓 栋，程 帆

(1武汉大学人民医院 泌尿外科，湖北 武汉 430000；2皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 泌尿外科，安徽 芜湖 241000)

睾丸扭转是青少年期和青春期常见的泌尿外科急症之一，其基本病理生理过程是扭转的精索使睾丸的血供减少或中断，导致组织发生缺血、坏死[1-2]。一旦确诊，应尽快恢复睾丸的血流供应，以防止睾丸生精细胞的损伤[3-4]。睾丸扭转引起的缺血损伤和睾丸复位引起的再灌注损伤均可造成睾丸组织生化和形态学变化，进一步导致生精功能的破坏，甚至不育[5]。研究证实长链非编码RNA肺癌转移相关转录本1(long non-coding RNA metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript1,lncRNA MALAT1)可通过多种信号转导途径，在多种系统和器官的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)过程中发挥作用，但IncRNA MALAT1对睾丸IRI的作用及其机制尚未见报道。本研究以睾丸生精细胞GC-1为研究对象，探讨IncRNA MALAT1在睾丸IRI过程中的作用，为睾丸扭转发病机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及器材 小鼠睾丸精原细胞GC-1,美国ATCC细胞库；DMEM培养基和胎牛血清,美国Gibco公司；转染试剂Lipofectamine2000及Trizol试剂,美国Invitrogen公司；MTT检测试剂盒及AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒，美国Biovision公司；RNA快速提取试剂盒,广州威佳科技有限公司；逆转录试剂盒及SYBR Green real time PCR试剂,Takara 生物有限公司。

1.2 细胞培养及转染 DMEM培养基培养精原细胞GC-1，培养条件为37℃、体积分数5%的CO2。细胞传代培养后给予缺氧3h环境后，复氧24 h后进行细胞转染。实验组转染IncRNA MALAT1和Si-MALAT1，对照组转染空白的NC和Si-NC。转染6 h后更换培养基继续培养24h，收集细胞进行后续实验。

1.3 逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中IncRNA MALAT1和miR-214的表达 TRIzol试剂提取各组细胞总RNA,逆转录合成cDNA，PCR仪进行扩增，检测IncRNA MALAT1和miR-214的表达。相应引物扩增的序列IncRNA MALAT1为F:5′-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3′，R:5′-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3′;miR-214为F:5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3′，R:5′-CAGACGAGGCTCCGTGGT-3′;GAPDH为F:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′,R:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′;U6为F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，R:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。采用2-△△Ct法计算IncRNA MALAT1和miR-214的相对表达量。

1.4 MTT实验检测细胞增殖 细胞增殖抑制的检测采用MTT比色法，将成功转染的细胞经胰蛋白酶消化后形成游离细胞后接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，置于37℃的培养箱中培养24 h。20 mL MTT溶液于37℃孵育4 h后弃去上清液，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，混匀后于490 nm处检测光密度(OD)值。

1.5 AnnexinV-FITC/PI法测定细胞凋亡 以等量DMSO为对照组，随后每孔加入1 mL培养基混匀后离心弃上清，收集细胞。无菌的PBS液漂洗并离心2次，500 μL PBS重悬后加入预冷的70%乙醇，在4℃冰箱留置过夜；次日加入1 mL PBS缓冲液吹打混匀，离心弃上清两次后向EP管加入300 μL PBS缓冲液重悬细胞，加入5 μL RNaseA(10mg/mL)，在37℃下静置1 h。最后加入700 μL 50 mg/mL的碘化丙啶(PI)，染色后进样流式细胞仪，观察细胞凋亡变化。

1.6 Western blot实验检测caspase-3和cytc蛋白表达 提取各组细胞蛋白，加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，混匀后置于冰上(4℃)裂解30 min，采用BCA试剂盒进行蛋白定量。用PVDF膜转膜后用含5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入caspase-3及cytc抗体,放置于4℃孵育过夜。采用羊抗鼠的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST液洗涤3次，每次10 min，在暗室中滴加超敏化学发光试剂(ECL)曝光显影。

1.7 荧光素酶报告实验 利用生物信息预测软件预测IncRNA MALAT1和miR-214的结合片段，用RT-PCR扩增IncRNA MALAT1上两者的结合片段，将合成IncRNA MALAT1片段插入到pMIR-Report Luciferase中，构建IncRNA MALAT1荧光素酶报告载体，将上述荧光素酶报告载体及突变载体共同转染至GC-1细胞,检测IncRNA MALAT1与miR-214的直接结合关系。

2 结果

2.1 lncRNA MALAT1和miR-214在不同复氧损伤时间的表达水平 本实验采用qRT-PCR方法检测GC-1细胞不同复氧损伤时间点IncRNA MALAT1和miR-214的表达。结果显示，随着复氧损伤时间的增加，IncRNA MALAT1表达增高(P<0.05)，尤其以缺氧3 h/复氧24 h细胞上调最为明显；而miR-214的表达降低(P<0.05)(图1A、1B)；相关分析显示，GC-1细胞中IncRNA MALAT1与miR-214的表达呈负相关(P<0.05)(图1C)。因此，本实验选择缺氧3 h/复氧24 h时间点用于后续的IncRNA MALAT1功能研究。

A.IncRNA MALAT1在不同复氧损伤时间GC-1细胞株中的表达情况(F=37.692，P=0.000)；B.miR-214在不同复氧损伤时间GC-1细胞株中的表达情况(F=67.814，P=0.000)；C.相关分析结果显示GC-1细胞株中IncRNA MALAT1与miR-214的表达相关性。与正常组比较，*P<0.05。

2.2 转染lncRNA MALAT1对GC-1细胞增殖和凋亡的影响 通过qRT-PCR实验检测IncRNA MALAT1转染效率。结果表明，过表达IncRNA MALAT1高于其对照组(P<0.05)，而沉默IncRNA MALAT1低于其对照组(P<0.05)(图2A);MTT法检测GC-1细胞增殖能力的变化。过表达IncRNA MALAT1使GC-1细胞的增殖能力下降(P<0.05),沉默IncRNA MALAT1使GC-1细胞的增殖能力增强(P<0.05)(图2B)；运用流式细胞术测定GC-1细胞凋亡水平的改变。过表达IncRNA MALAT1使GC-1细胞的凋亡能力增强(P<0.05)，沉默IncRNA MALAT1使GC-1细胞的凋亡能力被抑制(P<0.05)(图2C、2D)；Western blot法检测转染IncRNA MALAT1后GC-1细胞凋亡相关基因caspase-3和cytc蛋白水平的变化。过表达IncRNA MALAT1使caspase-3和cytc表达增加(P<0.05),沉默IncRNA MALAT1后使caspase-3和cytc表达减少(P<0.05)(图2E～2G)。

A.过表达IncRNA MALAT1和沉默IncRNA MALAT1后IncRNA MALAT1的表达情况(F=111.300，P=0.000)；B.转染IncRNA MALAT1对GC-1细胞增殖能力的影响(F=208.200，P=0.000)；C、D.转染IncRNA MALAT1对GC-1细胞凋亡能力的影响(F=35.440，P=0.000)；E～G.转染IncRNA MALAT1对GC-1细胞caspase-3和cytc蛋白水平的影响(F=46.720,P=0.000;F=38.210,P=0.000)。与各自对照组比较，*P<0.05。

2.3 lncRNA MALAT1靶向调控GC-1细胞miR-214的表达 生物信息学预测显示，IncRNA MALAT1序列中含有一段与miR-214互补结合序列(图3A)；本研究进一步构建了IncRNA MALAT1-Wt(野生型)以及结合位点序列突变IncRNA MALAT1-Mut的荧光素酶报告载体，与pri-miR-214或pri-miR-214 ctrl共转染GC-1细胞观察荧光索酶活性。结果显示，miR-214共转染的GC-1细胞中，IncRNA MALAT1-Wt表达水平降低(t=-7.056，P=0.002)，而MALAT1-Mut(突变型)相对荧光素酶活性变化差异无统计学意义(t=0.153，P=0.886)(图3B)；qRT-PCR实验显示,与对照组比较，过表达IncRNA MALAT1能抑制GC-1细胞miR-214表达(P<0.05),沉默IncRNA MALAT1能促进GC-1细胞miR-214表达(P<0.05)(图3C)。

A.生物信息学预测的IncRNA MALAT1-miR-214结合位点序列及其突变序列；B.荧光素酶报告载体试验检测IncRNA MALAT1-Wt和IncRNA MALAT1-Mut与pri-miR-214或pri-miR-214 ctrl共转染GC-1细胞的荧光素酶活性。与pri-miR-214 ctrl组比较，*P<0.05；C.转染IncRNA MALAT1对GC-1细胞miR-214水平的影响(F=42.160，P=0.000)。与各自对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

lncRNA是一类长度超过200核苷酸单位，在真核细胞基因组被普遍转录的非编码RNA分子。其多位于细胞核或细胞质内，通常由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，RNAPⅡ)转录生成[6-7]。研究已证实，lncRNA可通过多个层面调控基因的表达，在生物体生长、发育、衰老及死亡等过程中发挥重要的功能[8-10]。据研究报道，lncRNA在多种器官的IRI过程中发挥调控作用，UCA1在心脏IRI通过靶向p27的表达，发挥凋亡调控作用[11]；N1LR在脑IRI中可负调节Nck1基因的表达，减少脑神经元细胞的凋亡和促进增殖[12]；lncRNA AK139328在肝脏IRI中高表达，沉默AK139328可通过激活Akt信号通路，从而抑制NF-kB和caspase-3的活性，发挥抗凋亡以及抗炎作用[13]。

MALAT1又被称为核富集常染色体转录产物2(nucleraenriched autosomal transcript 2，NEAT2)，定位于11q13.1染色体上，全长约8 000 nt，是一种主要在核内表达、长度为8 kb且高度保守的、缺乏明确的开放式阅读框的ncRNA[14]。研究发现，IncRNA MALAT1在心脏和脑IRI过程中发挥了重要的调控功能。Zhao等[15]研究发现，IncRNA MALAT1可通过miR-145/Bnip3通路调节心肌细胞的凋亡；Li等[16]研究报道IncRNA MALAT1在脑IRI过程中，可减少脑血管内皮细胞诱导的细胞凋亡。本研究首先建立不同复氧损伤时间点的生精细胞GC-1模型，发现IncRNA MALAT1在复氧损伤后表达增高，而miR-214表达降低。为了明确IncRNA MALAT1在睾丸IRI中的生物学功能，本研究发现过表达IncRNA MALAT1可使GC-1细胞增殖能力降低，凋亡水平增加；而沉默IncRNA MALAT1可使GC-1细胞增殖能力增强，凋亡水平减弱，提示IncRNA MALAT1可能参与了睾丸IRI的发生及发展过程。为进一步探讨IncRNA MALAT1在睾丸IRI过程中的影响机制，本研究发现IncRNA MALAT1序列上存在连续的miR-214结合位点，且过表达IncRNA MALAT1能抑制生精细胞GC-1中miR-214的表达；而沉默IncRNA MALAT1后，miR-214表达水平增加，提示IncRNA MALAT1与miR-214在睾丸IRI过程中的靶向调控关系。

综上所述，本研究阐明了IncRNA MALAT1在睾丸IRI生物学行为中所发挥的重要作用，进一步揭示了IncRNA MALAT1分子可通过竞争性吸附miR-214来调控睾丸IRI过程中增殖和凋亡的能力，这将为睾丸IRI发病机制的探索提供新的思路及发展方向。