TKTL-1基因对神经胶质瘤细胞凋亡和迁徙的影响

刘 俊，盛 斌，陈 铭，张卿云

(皖南医学院第二附属医院 神经外科，安徽 芜湖 241000；2.上海交通大学医学院附属新华医院 神经外科，上海 200092；3.马鞍山市中心医院 神经外科，安徽 马鞍山 243000)

神经胶质瘤的发病率占原发性颅内肿瘤的第一位。神经胶质瘤患者即使接受了放疗和化疗的辅助治疗，但疗效仍不理想[1]。最近发现，人转酮醇酶样蛋白1(transketolase like protein 1,TKTL-1)基因的异常激活在神经胶质瘤的发生中起重要作用[2-3]。TKTL-1的高表达可能促进神经胶质瘤的发生。癌细胞需要足够的能量来使其快速生长。在肿瘤研究中发现了一种特殊的代谢途径，称为Warburg效应，其特征是在正常的氧气供应下，葡萄糖在癌细胞作用下可以发生糖酵解反应。此外，磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)的主要功能是将葡萄糖转化为核糖以合成核酸，转酮酶(transketolase，TK)系这一途径的关键酶。最近，有研究发现一些新型转酮醇酶如TKTL-1基因在许多恶性肿瘤中高表达，与肿瘤转移和预后不良有关。TKTL-1表达的增加可促进肿瘤的生长和转移。然而，TKTL-1促进肿瘤增殖侵袭的潜在机制仍不清楚[4]。

1 材料和方法

1.1 样本 采集2012年2月～2019年8月皖南医学院第二附属医院、上海新华医院、马鞍山市中心医院神经外科共65例原发性星形细胞瘤速冻标本。其中10例为毛细胞星形细胞瘤，12例为弥漫性星形细胞瘤，17例为间变性星形细胞瘤，26例为多形胶质母细胞瘤。从接受尸检的患者中收集5份正常脑组织样本作为对照。病理诊断根据世界卫生组织(WHO)2007年制定的中枢神经系统肿瘤分类标准执行。经三所医院的伦理委员会批准，所有患者均签订知情同意书。为了便于分析，将神经胶质瘤样本分为低级别(WHO Ⅰ和Ⅱ级)组和高级别(WHO Ⅲ和Ⅳ级)组。

1.2 细胞培养和试剂 将U87、U251人胶母细胞瘤细胞系(来自中国科学院上海生物科学研究所)在5%CO2的潮湿环境下使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。HAc细胞作为对照。

1.3 免疫组织化学 兔抗人TKTL-1多克隆抗体(1∶400，产品编号：ab155662，Abcam Trade Co.Ltd，上海)；PV-9000两步免疫组化测试试剂盒(中国杉木公司，北京)。磷酸盐缓冲液(PBS)用作阴性对照，阳性切片用作阳性对照。

1.4 免疫组织化学评估 使用免疫组织化学方法检测不同病理等级的人神经胶质瘤和正常脑组织中的TKTL-1蛋白。

1.5 细胞免疫组织化学 TKTL-1蛋白可视化处理(绿色)，抗TKTL-1抗体和二抗(红色)显示细胞质。细胞核用DAPI标记(蓝色)。放大1 000倍对照处理。

1.6 免疫印迹 分别从标本和细胞系制备组织切片裂解物和蛋白质。蛋白质在SDS-PAGE上分离。抗TKTL-1(CalBioreagents，M214)和β-肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich，上海)4°C下过夜孵育，二抗在含有2%BSA的PBS-T中室温孵育30 min。通过ImageJ软件(NIH，美国)进行信号定量分析。

1.7 RNA制备和实时荧光定量PCR 使用RNeasy提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从70个组织样品中分离出总RNA。使用逆转录试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将RNA样品逆转录为cDNA。使用Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG试剂盒(Invitrogen)在Rotor-Gene 3000实时机器(澳大利亚Corbett Research)中进行PCR扩增。β-actin用作标准化内源对照。使用解链曲线分析验证扩增特异性。通过2-△△T公式计算方法进行TKTL-1mRNA表达的计量分析。所有结果均至少进行3次重复实验。

1.8 RNA干扰及慢病毒载体的制备 对应于TKTL-1的SiRNA干扰靶序列选自基因库序号BC025382(GCAGTCAGATCCAGAGAAT，GTTGGCATGCAAAGCCAAT和CAACAGAGTCGTTGTGCTG)。将寡核苷酸插入pGCSIL-GFP慢病毒载体(美国，Invitrogen)。对U87和U251细胞系进行高感染率评估和确认。使用SiRNA干扰序列作为阴性对照。

1.9 免疫荧光 将用TKTL-1过表达质粒构建体转染的LM-MEL-44孵育72 h，4%多聚甲醛固定，用抗TKTL-1兔多克隆抗体(ab87187，Abcam)染色，将其以3 μg/mL浓度4℃下过夜，再在室温下用Alexa flour 555染料结合二抗染色45 min(Molecular probes,USA)。DAPI将细胞反向染色10 min。

1.10 克隆形成试验 用以评估单个肿瘤细胞形成集落的能力，在六孔板中制备0.8%琼脂培养基的底层。将受SiRNA干扰TKTL-1靶基因(RNA干扰组)或TKTL-1靶基因空白对照组感染的U251和U87细胞消化，离心，重悬于0.4%琼脂培养基中，铺在琼脂最底层。在37℃下生长14 d。使用Giemsa染色法观察菌落，在显微镜下计数。数据以对照组的百分比汇总。

1.11 体外细胞迁移和侵袭分析 将被TKTL-1 OE或TKTL-1 Scr感染后呈对数周期生长的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化重悬后制成单细胞悬液。将含有1×105个细胞的0.5 mL的无血清DMEM或EMEM接种到8 μm孔隙聚碳酸酯膜上，再插入到具有基质凝胶涂层的Transwell装置(Costar,Cambridge,MA)中。将含有10%胎牛血清的600μL DMEM或EMEM加入下层。细胞在5%CO2培养箱中于37°C孵育12～24 h后，棉签擦拭去除顶层的细胞。迁移到底面的细胞在100%甲醇中固定2 min，用0.5%结晶紫染色2 min，PBS漂洗，显微镜下放大200倍观察和计数。实验至少重复3次。

1.12 流式细胞仪分析 用以评估细胞周期分布。将5×105个细胞接种在100 mm培养皿中，培养基加入10%胎牛血清，过夜生长。将细胞用SiTKTL-1或对照病毒感染2天。随后，将培养基替换为无血清培养基24 h，并用10 mg/mL的铜蓝蛋白或载体处理细胞24 h。然后将细胞用胰蛋白酶消化，收集到冰冷的PBS中，并在4℃下用冰冷的70%乙醇的PBS溶液固定至少24 h。然后将细胞用1 mL碘化丙锭(PI)溶液(含20 mg/mL PI和20 mg/mL RNase的PBS)染色3 h，使用流式细胞仪(Beckman-Coulter，Fullerton，CA)进行分析。使用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡检测试剂盒(Bender Med System，CA)测量细胞凋亡。用胰蛋白酶消化在6 cm培养皿中培养的细胞，并在室温黑暗条件下用FITC偶联的抗-膜联蛋白V抗体染色15 min再用流式细胞仪(FACSCalibur，BD Biosciences)分析。

2 结果

2.1 TKTL-1在神经胶质瘤和正常脑组织中的表达 使用实时荧光定量PCR分析TKTL-1 mRNA在65个神经胶质瘤样品和5个正常脑组织样品中的表达。结果显示：正常脑组织、低级别和高级别神经胶质瘤中TKTL-1 mRNA的表达水平分别为1.00±0.28、21.46±3.17和41.58±3.06。神经胶质瘤组织中TKTL-1 mRNA的表达水平高于正常脑组织(P<0.05)，高级别神经胶质瘤组织中TKTL-1 mRNA的表达水平高于低级别神经胶质瘤组织(P<0.05，图1)。TKTL-1蛋白主要在星形细胞瘤细胞的细胞质中表达，而在正常脑组织中未见TKTL-1蛋白阳性表达。在高、低级别神经胶质瘤中TKTL-1蛋白的阳性表达率分别为97.67%(42/43)和63.64%(14/22)，高于正常脑组织(P<0.05)，如图2所示。

F=321.700，P<0.01；与N组比较，*P<0.05；与WHO低级别组比较，#P<0.05。

A.正常脑组织;B.WHO Ⅰ级神经胶质瘤;C.WHO Ⅱ级神经胶质瘤;D.WHO Ⅲ级神经胶质瘤;E.WHO Ⅳ级神经胶质瘤;F.WHO Ⅳ级胶质母细胞瘤对照。

2.2 TKTL-1在U87/U251细胞株中的表达 在U87和U251细胞中检测到TKTL-1 mRNA的表达。通过细胞免疫荧光(ISH)染色鉴定TKTL-1在U87/251细胞系中的亚细胞定位，TKTL-1 mRNA在细胞中可见(绿色)，细胞核用DAPI标记(蓝色)(图3A、3B)。实时荧光定量PCR分析结果表明，与对照细胞相比，U87和U251细胞中TKTL-1 mRNA的表达增加(P<0.01)(图3C)。Western blot结果显示，恶性神经胶质瘤细胞中TKTL-1蛋白表达较正常星形胶质细胞增加(图4)。因此，TKTL-1表达与胶质母细胞瘤细胞的增殖活性相关。用TKTL-1或对照组慢病毒颗粒感染并培养U87和U251细胞48h后分离RNA，进行实时荧光定量PCR检测TKTL-1 mRNA的表达水平。数据显示，干扰TKTL-1后，mRNA的表达下降(P<0.01)(图3D)。而Western blot结果也表明，干扰mRNA后恶性神经胶质瘤细胞中TKTL-1蛋白表达降低(图4)。

A、B.免疫荧光显示TKTL-1在U251和U87细胞系中表达升高；C、D.当TKTL-1被干扰后，其表达量下降(F=236.700，P<0.01；tU87=3.862，PU87=0.018；tU251=3.674，PU251=0.021)。

图4 SiRNA干扰后U87和U251细胞系中的TKTL-1蛋白表达

2.3 SiTKTL-1对U87和U251细胞株表型变化的调节作用 流式细胞仪分析表明，TKTL-1基因的干扰可导致U87和U251细胞株早期凋亡，而对照组细胞(Scrambled组)未见明显变化(P<0.05，图5A)。细胞周期分析表明，在U87和U251细胞中，与Scrambled组相比，TKTL-1 SiRNA组中的G1期细胞减少，而S期中细胞的比例增加(P<0.05，图5B)。此外，克隆形成分析表明，抑制TKTL-1的表达降低了U251和U87细胞中肿瘤细胞克隆的形成(P<0.01，图6A)。此外，Transwell分析显示，与Scrambled组相比，TKTL-1被干扰后U251和U87细胞中侵袭的肿瘤细胞数量减少(P<0.01，图6B)。此外，蛋白质印迹分析显示使用RNA干扰TKTL-1后神经胶质瘤细胞株(U251/U87)HIF-1α蛋白表达降低(P<0.01，图7)。这些数据均支持了TKTL-1在神经胶质瘤细胞增殖诱导中的调节作用。

A.与对照组(Scrambled)相比U251/U87细胞凋亡增加(t=9.610，P=0.011)；B.在G1期发生阻滞，S期延长(U87:t1=7.348，P<0.01；t2=1.224，P=0.288；t3=10.392，P<0.01。U251：t1=5.284，P<0.01，t2=2.771，P=0.080，t3=4.849，P<0.01)。

A.t1=8.355，P<0.01；t2=8.464，P<0.01；B.t1=6.911，P<0.01，t2=5.530，P<0.01。

图7 TKTL-1被SiRNA干扰后U87和U251细胞系中TKTL-1和HIF-1蛋白的表达情况

3 讨论

本研究发现，与正常脑组织相比，神经胶质瘤组织标本中TKTL-1 mRNA和蛋白的表达显著增加。并且本研究还明确了干扰TKTL-1基因对神经胶质瘤细胞株的影响。TKTL-1被SiRNA干扰后，神经胶质瘤细胞的活性显著降低，细胞凋亡增加。TKTL-1基因的干扰使神经胶质瘤细胞停滞在G0/G1期，S期的细胞比例明显下降。同时，TKTL-1基因的干扰还抑制了神经胶质瘤细胞的侵袭和聚集。此外，TKTL-1基因的干扰也抑制了HIF-1α的蛋白表达。数据还表明，TKTL-1基因的表达可能促进神经胶质瘤的发生和发展。Millares等[5]研究发现PPP是癌细胞通过葡萄糖合成核酸的重要途径。核酸在生物代谢，尤其是细胞生长和分裂中起着重要作用。大多数肿瘤细胞生长所需的5-磷酸核糖直接或间接通过未氧化的PPP，而TKTL-1是PPP非氧化分解的关键调节酶。Dong[6]发现TKTL-1可以通过PPP调节葡萄糖的代谢。在TKTL-1过表达后，PPP的活性增强，导致更多的戊糖-5-磷酸和减少的辅酶Ⅱ，并通过甘油醛-3-磷酸产生乳酸，而这对于肿瘤细胞的生长和增殖是必需的。乳酸可使周围的组织酸化，并产生CO2以进一步增强酸度，从而导致组织的pH降低。酸性环境可促进肿瘤血管生成，降解基质蛋白并抑制免疫反应，从而确保肿瘤细胞存活和肿瘤浸润，而正常的外周细胞则无法耐受这种酸性微环境并死亡。研究表明，TKTL-1表达在许多恶性肿瘤中显著上调，例如非小细胞肺癌、胃癌、甲状腺癌、转移性和进行性肾细胞癌、直肠癌[7-11]。TKTL-1的表达水平与肿瘤的侵袭、转移和预后密切相关。另外，Diazmoralli等[4]发现TKTL-1在人肝癌细胞系中高表达。在通过干扰RNA抑制TKTL-1的表达后，癌细胞的生长和增殖被显著抑制。在人类结肠癌细胞的研究中也获得了类似的结果。然而，TKTL-1与神经胶质瘤的发展及其机制之间的关系仍然不是很清楚。为了进一步研究TKTL-1的表达与神经胶质瘤细胞增殖之间的关系，本研究通过干扰RNA抑制神经胶质瘤细胞中TKTL-1的表达，使得神经胶质瘤细胞的增殖被显著抑制，并且被转染了抗TKTL-1 SiRNA的U87和U251系细胞也出现了G0/G1期阻滞。这表明TKTL-1在神经胶质瘤细胞的细胞增殖中起着重要的作用。另外，将过表达的TKTL-1质粒转染肝癌细胞株中发现肿瘤细胞增殖加速，HIF-1α mRNA表达和蛋白质水平显著增加[11-12]。因此，我们推测TKTL-1可以为肿瘤细胞的生长和增殖提供原材料，而且还可刺激HIF-1α的表达并促进血管生成以适应低氧的微环境。这两个基因协同促进了肿瘤的发生和发展。本研究证实TKTL-1基因的干扰也可以减少HIF-1α的表达。提示TKTL-1靶向治疗可能成为减少神经胶质瘤复发，延长患者生存时间，提高患者生活质量的一种新方法。然而，哪些信号转导途径是TKTL-1和HIF-1α促进神经胶质瘤发展的机制，并且TKTL-1是否为神经胶质瘤的起始因子有待进一步研究考证。