miR-432、miR-646和miR-100在骨肉瘤细胞中的表达

周中明，严小虎，梁 磊

骨肉瘤是一种最常见的原发性的恶性骨肿瘤[1]，多发于20岁以下的青少年或儿童[2]，在小儿骨恶性肿瘤中最多见，约占小儿肿瘤的5%。骨肉瘤具有高侵袭能力、恶性程度高和预后不良等特点，且男性的发病率高于女性[3]。由于其发病机制较复杂，预后差，经各种化疗和辅助治疗，病人5年的存活率可上升至60%～80%[4]。然而骨肉瘤的转移性较早，且容易产生耐药性，所以其复发和转移的风险较高[5]。目前，临床上对骨肉瘤的早期诊断仍很困难，生物学标志物的灵敏性和特异度均不高，导致对骨肉瘤的诊断价值欠佳，因此急需找到对骨肉瘤早期诊断的标志性物质。近年来，微小RNA(miRNA)的异常表达可影响肿瘤的发生和发展过程。miRNAs是一种高度保守的非编码的单链RNA，其在机体内通过在RNA转录水平上结合特异性的靶基因，从而达到基因沉默的效果，充当“基因海绵”的作用，从而发挥调节功能[6-7]。相关报道证明，miR-432作为一个新发现的miRNA，在肿瘤的发生过程中发挥着调节作用，在肺癌、胃癌和宫颈癌等肿瘤组织中显著下调[8]，但在骨肉瘤中的表达情况及作用机制尚未明确。另有研究[9-11]发现，miR-646与肝癌的发生于易感性密切相关，也被证明在肺癌、肝癌和肾细胞癌中表达降低的现象。而miR-100属于miR-99家族的一员，可随着人类肿瘤微环境的改变而发挥着促癌或抑癌的作用[12-13]。研究表明，miR-100在肝癌、乳腺癌和宫颈癌等肿瘤中低表达[14]，在骨肉瘤中的作用却鲜有报道。因此，本研究通过对骨肉瘤病人中miR-432、miR-646和miR-100的表达研究，分析其与临床病理参数的相关性，分析它们之间表达水平的相关性，为骨肉瘤的诊断、治疗及预后提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年2月至2019年2月首次治疗并经病理确诊为骨肉瘤的72例病人作为研究对象。纳入标准：(1)所有病人均经病理组织学确诊；(2)所有病人的临床资料均完整性高，且顺从性好；(3)经病人及其家属同意，签署知情同意书。排除标准：(1)伴有高血压、长期酗酒等病人；(2)伴有心血管、肾脏病变等病人；(3)伴有其他恶性肿瘤的病人；(4)伴有精神病病人。骨肉瘤病人男39例，女33例；年龄10～40岁；病人肿瘤直径≥7 cm的37例，<7 cm的35例；临床TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例。参照夏贤良等的方法计算肿瘤坏死率(tumor necrosis rate，TCNR)(%)[15]，≥90%的32例，<90%的40例。另外选取骨模型骨肉瘤旁组织38例作为对照组，所有研究过程均符合我院医学伦理委员会的相关规定。

1.2 实验材料与仪器 Trizol试剂由美国Invitrogen公司提供，cDNA第一链合成试剂盒和SYBR Green Master Mix试剂盒均由Vazyme公司提供，酶联免疫试剂盒由ebioscience公司提供，miR-432、miR-646和miR-100引物由南京金唯智生物技术有限公司合成。引物序列见表1。主要仪器为Thermo公司生产的紫外分光光度计和TCA5020的普通PCR仪，美国ABI公司的7500-实时荧光定量PCR仪，日本SANYO公司提供的凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司提供的电泳仪和电泳槽，多功能酶标仪由美国Thermo公司提供。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 实验方法 每对组织为肿物和瘤旁组织(距离病灶≥5 cm)，在手术切除后10 min之内获得。取材后置于无菌冻存管中，储存于-80 ℃。应用RT-PCR法检测miR-432、miR-646和miR-100的表达水平。用Trizol试剂提取组织细胞中RNA，整个过程严格按照操作说明书进行。提取骨肉瘤病人组织细胞和骨肉瘤旁组织细胞的RNA。miR-432、miR-646和miR-100逆转录引物序列为5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA TGG TT-3′。具体的逆转录条件为16 ℃(30 min)，42 ℃(30 min)和75 ℃(15 min)，在进行PCR反应时，先使用95 ℃变性10 min，温度维持15 s，而后用60 ℃反应1 min，连续进行40个循环，每个反应平均进行3次。对反应管中荧光信号达到指定区域经历的循环数，即Ct值，采用U6为内参，使用相对定量法计算肿瘤组织目的基因表达水平与配对的正常组织相差的倍数，即2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(肿瘤CtmiRNA-CtU6)-(正常CtmiRNA-CtU6)。

1.4 观察指标 对比骨肉瘤组织和骨肉瘤旁的组织细胞miR-432、miR-646和miR-100的表达差异，同时分析其与临床病理参数之间的联系，另外对miR-432、miR-646和miR-100表达水平的相关性进行分析。

1.5 统计学方法 采用t(或t′)检验、方差分析、q检验和Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 miR-432、miR-646和miR-100在骨肉瘤和骨肉瘤旁组织细胞中的表达水平比较 与瘤旁组相比，骨肉瘤组的miR-432、miR-646和miR-100的表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

表1 2种组织细胞中miR-432、miR-646和miR-100的表达水平

2.2 骨肉瘤病人组织细胞中miR-432、miR-646和miR-100的表达水平与临床病理参数特征的关系 骨肉瘤组织细胞中miR-432、miR-646和miR-100的表达水平与病人的性别、年龄、肿瘤直径、组织学类型、发病部位和TCNR均无关(P>0.05)，而与病人的TNM分期和是否发生肺转移相关，miR-432和miR-100表达量随着TNM分期增加而降低，miR-646表达量Ⅲ期低于Ⅰ期和Ⅱ期，发生肺转移病人miR-432、miR-646和miR-100表达量均低于非肺转移病人，差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01)(见表2～4)。

表2 骨肉瘤病人组织细胞中miR-432的表达水平与临床病理参数特征的关系

续表2

表3 骨肉瘤病人组织细胞中miR-646的表达水平与临床病理参数特征的关系

2.3 骨肉瘤病人中miR-432、miR-646和miR-100的表达量间的相关性分析 Pearson相关性分析发现，骨肉瘤病人中miR-432的表达水平与miR-646和miR-100的表达水平呈正相关(r=0.76和0.79，P<0.05)，而肿瘤病人中miR-646的表达水平与miR-100的表达水平同样呈正相关(r=0.81，P<0.01)(见图1～3)。

表4 骨肉瘤病人组织细胞中miR-100的表达水平与临床病理参数特征的关系

3 讨论

骨肉瘤是青少年及儿童极易发生的一种常见原发性恶性肿瘤，它生长速度极快，且很容易发生远隔器官转移[16]。多年前，由于医学影像技术和化疗药物未曾有效普及，临床上大都采用截肢的手术进行治疗；虽然截肢手术能够最大程度限制肿瘤的复发和转移，但据以往研究报道显示，骨肉瘤病人5年内的存活率仍低于20%[17]，且大都死于肺转移。近年来，随着医学的迅速发展，骨肉瘤的治疗和预后得到了极大的改善。但临床上，我国对骨肉瘤的化疗疗效的提高并不显著，没有形成一个统一、规范的化疗方案。仍有接近40%的病人的化疗预后不良，骨肉瘤的治疗需要进一步拓展思路，寻找新的治疗方法。随着分子生物学的发展，miRNAs是近年来研究发现并成为研究热点的一类小分子编码RNA。miRNAa在肿瘤中有表达谱的改变[18]，miRNA可成为潜在的肿瘤诊断的生物学标志。

目前，大部分miRNA分子都是通过与靶基因的3′UTR区域结合而发挥细胞调节作用。相关研究[19]表明，miR-432在肝癌组织或细胞中表达明显下调，过表达miR-432可显著抑制肝癌细胞的增殖及成瘤，其中可能的作用机制是miR-432参与了Wnt/β-catenin信号通路上某个靶基因发挥着调节作用。而根据Targetscan和miRbase等软件可预测出，miR-432对应的靶基因为人趋化因子CX3CL1，miR-432可以和CX3L1的3′UTR区域的结合位点结合，而CX3L1是属于趋化因子家族成员，在大部分肿瘤中表现为高表达水平。miR-432通过调控CX3L1基因的活性参与肿瘤细胞增殖与侵袭过程的发生与发展。所以miR-432在其中发挥着抑癌的作用。而本文研究中也发现骨肉瘤组织细胞中的miR-432的表达水平显著低于骨肉瘤旁组织(P<0.01)，与以上结论保持一致。miR-646也被证明在多种肿瘤细胞中表现出低表达水平，我们通过Targetscan软件预测其靶基因为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，多个文献[20-22]报道显示，EGFR在骨肉瘤中表现出高表达水平，属于一种细胞黏附因子，在大部分肿瘤如肝癌、胃癌、肺癌和宫颈癌等组织细胞中均表现出高表达水平，且可促进骨肉瘤的发生与发展。其可能的机制是miR-646通过与EGFR的3′UTR启动子区域结合调节了EGFR的活性，从而参与了骨肉瘤的增殖与转移的过程，发挥着抑癌作用。而本文研究中也发现骨肉瘤组织细胞中的miR-646的表达水平显著低于骨肉瘤旁组织(P<0.01)，与以上结论保持一致。另一种miRNA即miR-100在骨肉瘤组织细胞中表达也是显著降低(P<0.01)。相关研究报道显示，miR-100可通过靶基因于Polo样激酶(polo-like kinase 1，PLK1)的表达抑制肿瘤细胞的增殖，同样，PLK1在多种肿瘤中均表现出高表达水平，且具有促进肿瘤细胞转移与侵袭的作用，发挥着促癌的作用，因此，miR-100通过调节PLK1的活性，发挥着抑癌作用[23]。在研究miRNA与临床病理参数的关系中，我们发现miR-432、miR-646和miR-100均与TNM分期和是否发生肺转移具有相关性(P<0.05～P<0.01)，说明miR-432、miR-646和miR-100与骨肉瘤的增殖与转移密切相关。

Pearson相关性分析发现miR-432、miR-646和miR-100的表达水平之间均具有正相关。其可能的作用机制均为miR-432、miR-646和miR-100通过“海绵效应”，在mRNA水平分别与EGFR、PLKK1等靶基因相结合，而靶基因通过多种代谢途径调节骨肉瘤细胞的增殖与发展，从而达到miRNA影响了肿瘤细胞在病人体内的变化的作用。但其具体机制仍需进一步探索。

综上所述，miR-432、miR-646和miR-100在原发性骨肉瘤的发生与发展中发挥着至关重要的作用，不仅仅对于骨肉瘤早期的诊断和治疗具有重要的临床意义，对于骨肉瘤病人的预后提供了理论支持，但是miR-432、miR-646和miR-100的相互作用仍需要深入探讨。