慢性支气管炎动物模型的研究进展*

崔 爽 张明倩 梁五林 张硕峰

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

慢性支气管炎(chronic bronchitis，CB)是一种十分常见的慢性炎症，集中发作于气管、支气管黏膜及周围组织。病程初期表现较缓和，冬季发病较频繁而待春天回温后情况转好，以每年发病至少三个月，持续表现两年或更长时间为特征。晚期一般表现为病情加重，症状常年存在[1-2]，进而发展为慢性阻塞性肺疾病(COPD)。CB表现为呼吸道的感染，与吸烟、理化因素(如：二氧化硫、氯气、刺激性烟雾等)及感染因素(如细菌、病毒等)相关，还涉及年龄、环境等因素。此外，由免疫因素[3]引起的支气管黏膜充血水肿和坏死、纤毛无法正常运动、功能亢进等持续炎症与CB的发生也有密切的关系。

现阶段，通过实施药物干预以减轻CB感染程度进而减轻症状已成为研发相关药物的关键。选用模型动物并选择性排除干扰因素能够更直观地了解其发病因素、病理特征和发病机制，对后期的临床研究及新药的开发提供重要材料。考虑到实验动物的繁殖周期、实验成本、动物基因组研究进程等多种因素，大鼠、小鼠[4]、豚鼠等广泛应用于复制CB模型。根据诱发CB模型的方法，归纳总结如下。

1 烟熏法

烟熏法是模拟人类吸烟对呼吸道的刺激，引发CB的病理过程的一种造模方法。由于烟草形成的烟雾中含有焦油、氢氰酸、菸碱、尼古丁等多种化学物质，可严重损伤实验动物的呼吸道的防御屏障，导致呼吸道黏液分泌增多、纤毛运动受阻引起痰液增多；同时支气管痉挛，气道阻力增加造成通气障碍；气管黏膜损伤、气道重塑，引起气道顺应性下降，最终导致CB的病理变化[5]。本方法的优点是简便易行，较接近临床实际，能够更好的模拟CB的发病过程，故成为CB最常用的造模方法。缺点是(1)成模时间长；(2)致烟剂原料的成分和种类以及烟雾浓度难以控制，加之烟熏时长和频率的不同，导致不同实验室所复制的模型动物的病理反应轻重不一致；(3)本方法在实施过程中对环境污染较大，难以实施。

烟熏法多以单一烟丝或混合烟雾材料[6](如烟叶、锯末、刨花各50 g)为刺激物置于特制烟室制备CB模型。目前，多采用大鼠或小鼠作为实验动物，30～50 min/次，2～4次/d，持续28～60 d。结果显示模型组小鼠气道上皮出现大量炎细胞浸润，腺体分泌功能亢进，有黏液栓形成，肺泡灌洗液中白细胞总数和中性粒细胞数量明显增加，蛋白含量上调，血浆和肺组织匀浆的超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力降低，丙二醛(MDA)含量增加。其成模机制可能与氧化应激过强有关[7]。魏星等[6]得出模型组大鼠CB形成呈现渐进性发展过程，表现为口鼻腔黏膜色泽紫红、分泌物较多及咳嗽喘息程度加重，其病理形态学表现为肺泡壁变薄、黏膜杯状细胞增生以及炎性细胞浸润。刘延祯等[8]发现CB大鼠肺组织中白介素-2(IL-2)含量明显降低，白介素-8(IL-8)含量明显升高，表明趋化炎性细胞和释放炎性因子可引发炎症反应[9-10]。卫智权等[11]分析得模型组大鼠单核细胞NF-κB(P65)与IκBα的动态平衡失衡引起病理性损伤，其体内外周血单个核细胞(PBMC)大量募集并激活，产生大量肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、IL-6[12]等炎症细胞因子。由于PBMC的IκBα表达水平未出现相应提升，使PBMC的NF-κB(P65)持续激活造成炎症持续损伤而慢性化。同时，肺组织超氧化物歧化酶1(SOD1)、SOD2、SOD3、IL-2、IL-4及其基因表达下调，白介素-1(IL-1)、TNF-N及MDA水平提高，CD4+T淋巴细胞比例上调，肺组织HE染色病理表现为明显的慢支特征[13-14]。

烟熏法致CB模型的建立呈渐进性发展，优点是简便可靠，炎症病变确切，有助于研究CB发生发展过程中各阶段的病理变化以及相应炎细胞浸润及炎性标志物的变化，为临床早期诊断和治疗提供理论依据。缺点是致烟剂原料种类单一，其燃烧产生的烟雾浓度难以控制，且实验周期较长，稳定性较差[15]。

2 化学药物法

多种化学药物能够引发CB，常见的药物有二氧化硫、氯气、氨水和脂多糖(LPS)。此外，酶、硝酸、氯化镉、二氧化氮、胆碱能药物、促分泌素等物质也对支气管造成一定的损伤进而引发炎症。优点是简便易行、快速可靠且药物剂量可控，缺点为各药物对气道损伤的病因不同，具体反应部位以及程度也有差异。

2.1 二氧化硫吸入法

二氧化硫吸入法多采用大鼠及小鼠作为实验对象，将不同浓度的二氧化硫置于玻璃钟罩或者特制熏箱，将实验动物分批放入进行10 s～30 min熏制，1次/d，全程15～28 d[16-18]。

杨帆等[16]发现模型组小鼠体质量明显减轻，肺气管组织病变明显，各级支气管都可见黏液栓，咳嗽次数显著增加，黏膜组织杯状细胞增生和淋巴细胞、浆细胞等大量炎症细胞浸润。白旭华等[17]得出模型组小鼠支气管管壁部分上皮变性脱落，局部出现鳞状上皮化生，气管和支气管黏膜杯状细胞大量增生。尹永芹等[18]分析得出模型组大鼠出现哮鸣及呼吸困难，支气管黏膜浸润程度加重且导致上皮细胞明显脱落，肺泡腔出现气肿改变，肺泡壁有间质炎，肺组织匀浆TNF-α水平显著上调, 而IL-10和IL-4水平则显著下调(P<0.01)。

本方法能够引起CB的病理变化，病情发展严重后甚至导致气流阻塞并发肺气肿。本方法快速简易，但对气管及支气管的刺激性较大，过量的二氧化硫会引起呼吸道黏膜烧灼伤，上皮细胞增生坏死，容易导致动物模型发生急性损伤甚至死亡，故选用合适的浓度以及建立过程，使气道损伤程度适中尤为重要。

2.2 氨水雾化法

因小鼠对于氨水的敏感性更高，伴有明显的腹肌收缩或缩胸, 同时张大嘴, 伴有咳嗽声等表现，故氨水雾化法多采用小鼠作为实验对象。侯颖等[19]采用氨水雾化引咳以制备小鼠CB模型，2 min/次，每次间隔0.5 h，5次/d，连续10 d，10 d后采用氨水雾化2 min/次，每次间隔0.5 h，2次/d，连续20 d，全程总共30 d。模型组咳嗽次数明显增加、支气管黏膜上皮细胞空泡变性增生、细支气管皱缩、炎性细胞浸润、纤毛发生倒伏脱失、部分肺泡隔断裂成肺大泡、管腔大量浆液渗出及肺间质血管扩张淤血。本方法简便易行，但在实施过程中污染较大。

2.3 氯气吸入法

暴露于低浓度的氯会优先对大呼吸道造成损害，而对肺泡损害较弱，从而造成广泛气道损害。高浓度的氯(800 g/m3、5 min)会直接导致呼吸道和肺泡双重损伤进而导致急性气道炎症反应的发生。由于氧化应激标志物的发现以及低分子量抗氧化剂对异常情况的缓解，进而证明氯气对气道造成的损害本质上是氧化性的[20]。

2.4 LPS注射法

LPS是蛋白质、类脂质及多糖的复合物，也是重要的致炎因子，可引起气道上皮损伤，激活炎性细胞并释放炎性因子，诱导气道炎症。本方法多采用小鼠或大鼠作为实验对象，采用气管滴注等方法制备CB动物模型。

马楠等[21]得出模型组大鼠肺组织表面无液体渗出及出血，呈灰白膨胀状态，支气管平滑肌增厚，部分纤毛上皮细胞变性脱落、连接间隙增宽，复合纤毛生成、管壁可见慢性炎细胞浸润、杯状细胞增生及管腔内充满以中性粒细胞为主的炎细胞以及黏液。曹强等[22]通过对肺灌洗液的成分分析得出，模型组MDA、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALB)、谷胱甘肽(GSH)和碱性磷酸酶(AKP)5个指标的含量均有所上调，巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量显著增加。CD11c/CD18和CD14作为细菌脂多糖受体可参与激活巨噬细胞, 前者可直接与LPS结合，而后者需在LPS的刺激下借助血清蛋白尤其是脂多糖结合蛋白(LBP)与CD11c/CD18结合成复合体，由此可通过膜上CD11b/CD18介导细胞从而进行进一步活化，干扰TNF-α、IL-1、IL-10、TGF-β1等细胞因子的释放，肺泡巨噬细胞胞浆游离钙也升高，引起CB的气道炎症。

本方法简单经济、易定量、耗时短且污染较少。由于LPS注射法具有足够的刺激强度，同时又考虑到人类CB的发病机制，故可成功复制出CB的动物模型。其缺点是LPS过量会导致急性肺损伤改变，不利于CB的阶段性观察，故前期造模条件的摸索尤为重要[5]。

2.5 甲醛刺激法

叶根荃等[23]选用20%的甲醛(10 mL)刺激模型组小鼠1 h，连续刺激30 d的方法复制CB模型。自第10天起，该模型中小鼠的气管及支气管黏膜出现轻度充血水肿、杯状细胞轻微增生、炎性细胞浸润及肺间质轻度充血。随造模时间延长，小鼠体质量日益减轻，同时炎症逐渐加重。自20 d起，部分上皮鳞状化生明显，较大支气管出现不同程度的炎性细胞浸润。直至第30 d，黏膜充血明显，中、小支气管黏膜上皮细胞出现灶性变性坏死、脱落，杯状细胞大量增生，大量黏液分泌及分泌物增加。本方法优点是装置和操作简单，成本较低，实际应用较为方便。缺点为甲醛易挥发，污染环境。

3 复合刺激法

由于动物与人类在解剖学、炎症或纤维化的严重程度上的差异，或是动物炎症模型缺乏对实验方案和实验条件的完整病理现象，故单因素的造模方法不能完全模拟人类CB的病理改变。所以，采用多因素刺激方法即复合刺激法可以更好的建立符合人类CB病理改变特点的CB动物模型[24]。同时，也有助于推进新型CB动物模型的开发与应用。

3.1 气管内注射LPS联合烟熏法[25-26]

气管内注射LPS联合烟熏法多以小鼠和大鼠作为实验对象，以香烟或混合烟雾材料与LPS交替或者重叠刺激的方式复制CB模型[27-28]。王瑛[29]发现模型组大鼠表现为毛发凌乱无光泽及气喘气促，28 d后体质量明显下降，支气管管壁炎症细胞大量浸润、肺泡壁出现明显水肿、支气管平滑肌增厚断裂、杯状细胞增生且部分气道黏膜上皮纤毛黏连及脱落。潘朝旺等[30]发现模型组大鼠血清TNF-α、IL-13和IL-8含量均上调。凌嫘等[31]发现前炎症因子TNF-α受到理化等刺激后持续释放至血液以及组织，激活p38 MAPK通路参与中性粒细胞的信号传导，加剧炎症细胞的聚集，从而加重炎症反应以至于呼吸道感染反复发作。在气管内注射LPS联合烟熏法中，其优点为所需时间相对较少，但操作较复杂，实验过程中存在一定死亡率[32]。

3.2 LPS联合卡介苗法

郭磊等[33]采用5 mg卡介苗(尾静脉注射)联合200 μg LPS(气管插管)的方法，持续三周后成功复制大鼠CB模型。模型组，肺组织匀浆TNF-α和IL-8水平显著上调，而IL-10水平下调[34]。支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数、中性粒细胞以及肺泡巨噬细胞比例显著升高。同时，肺泡巨噬细胞一氧化氮含量及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性均表现出明显的提高(P<0.05)。本方法较独用LPS更为典型，但很难复制出气管腺体增生的形态学改变，可能是大鼠气管与支气管腺体不发达之故[35]。

3.3 气管滴入LPS联合肺炎克雷伯杆菌反复感染法

赵春贞等[36]选用雄性SD大鼠用静脉套管针注射肺炎克雷伯杆菌菌液(0.1 mL), 2次/周, 每滴入该菌液三次后, 采取相同的方法注射0.1 mL的LPS(200 μg)，以此循环直到12周后复制出大鼠CB模型。模型组BALF中白细胞总数明显增多，炎症细胞浸润、肺泡明显扩张、杯状细胞数明显增多、肺泡壁变薄并存在部分撕裂、肺组织匀浆MDA含量上调且支气管和肺泡上皮细胞内核转录因子E2相关因子(Nrf2)蛋白表达明显增多。本方法为细菌感染在相关肺部疾病的作用提供相应的数据支持，其病理特征与人体相符，具有重要的应用价值。

3.4 注入LPS联合被动吸烟及二氧化硫吸入法

杜秀婷等[37]采用4周龄KM小鼠在实验的第1、14天分别经鼻腔和经气管注入LPS，其余天数选用二氧化硫吸入联合被动吸烟的方法进行CB模型的制备，总计30 d。复合组小鼠体毛干枯无光泽、体质量增加缓慢、气道内分泌物增多、管壁有明显的炎性细胞浸润、白细胞总数显著增高(P<0.01)且出现明显的腔内炎性渗出。本方法准确可靠，针对CB发病学、组织病理学、BALF细胞学等方面分析，LPS、烟熏和二氧化硫联合造模更符合CB模型的建立。

3.5 LPS联合烟熏叠加18%低氧法

蒋明等[38]将Wistar大鼠气管内注入LPS 200 μg，共计2次(第1、14天)；烟熏2 h/d，共计6周，第5、6周采用烟熏叠加18%低氧，8 h/d，6 d/周。模型组炎性细胞浸润、RVSP和mPAP值上调明显、肺泡间隔可见淤血、管腔中以中性粒细胞为主的白细胞数量大幅度增加且部分可见上皮麟状化生。本方法大鼠气道、肺组织改变更加符合人类CB及肺气肿的病理改变特点，为临床的病例诊断和治疗提供相关思路。

3.6 LPS联合寒冷刺激和烟雾吸入法

刘荣强等[39]采用LPS注入联合寒冷刺激加烟雾吸入的方法建立大鼠CB模型。方法如下：分别在第1、14天将200 μg LPS溶液(1 μg/μL)注入气管后旋转大鼠使LPS在肺部分布均匀，其余每天烟熏两次，每次点燃10支香烟熏30 min，两次烟熏间隔4 h，末次烟熏后对模型动物进行寒冷刺激，12 h/d，共计30 d。结果显示，CB组大鼠出现萎靡现象、鼻部有白色或黄色分泌物、肺组织出现气道损伤和炎症细胞浸润、其血清IL-2和IL-4表达明显上调(P<0.05)及肺组织和支气管AQP-1表达下调(P<0.05)。通过叠加多种因素建立大鼠CB模型能够扬长避短，设计更为全面，方法简单易操作。

4 结果与讨论

CB模型的成功建立与否可通过肺功能指标、BALF细胞学指标、组织病理学特征等方面来进行评价，多表现为实验动物气道阻力的增加和肺顺应性的下降；肺组织出现炎细胞浸润、肺泡塌陷，肺泡间隔增厚和肺出血等；气道上皮杯状细胞化生；BALF中白细胞总数、中性粒细胞以及巨噬细胞数量增加等症状，其机制可能与炎症反应、黏液高分泌、气道重塑等有关。目前建立CB动物模型的方法种类繁多，每种方法各有其优缺点。烟熏法简单易行，其他合并疾病出现概率少，但成模时间长且不易复制、难以标准化操作；化学药物法快速可靠，药物剂量可控，但所需设备和操作复杂，各药物所造成的病理机制也有不同，对于二氧化硫、氯气等有毒气体，吸入后会造成严重的呼吸道黏膜烧灼伤，故调整气体浓度和实验条件最为关键；LPS注射法可复制性强，具有足够的刺激强度，病理变化表现稳定且组内差异小，是目前较为流行的致病药物，但由于其本身具有一定毒性，实行过程中应注意给药方法；复合刺激法弥补了部分单因素致病建模方法的局限性，完善实验方案和实验条件的病理现象，建立更符合人类CB病理改变特点的模型。

5 问题与展望

由于实验动物与人类的气道存在解剖学、炎症或纤维化上的差异，上述造模方法皆不能完全模拟CB病理特点, 需在造模方法、试剂用量以及频率等方面反复推敲，对比并分析各方法结果的差异，不断完善CB模型的研究，同时对于其他新型造模方法的建立进行进一步的研究和探索。此外，针对模型动物种类的选择也十分关键，豚鼠易致敏且价格较高, 缺少相关的蛋白质抗体和分子学研究工具；大鼠气管腺体不发达，对于气管腺体增生的形态学表现并不明显；大型动物实验数量较少且存在伦理问题, 实际应用的可能更小。虽然动物模型的病理过程和临床特征与人不完全一致，但其可以作为一种良好的实验室工具进行评估，大鼠基因组与人的基因组序列较为相似，且大鼠的繁殖速度、生命周期较为合适, 能够缩短研究周期并提高造模结果的准确性，帮助了解CB的病理特点和发展进程，从而产生潜在的干预措施以进行有效地控制。同时，CB模型的探索也有助于防治药物的进一步探索研究，对临床研究具有十分重要的意义。