香樟茎段组培快繁技术研究

何婷，宋晶晶，陈钟，孔箫，项艳*

（1.安徽农业大学林学与园林学院，安徽 合肥230036；2.望江县林业局，安徽 安庆246200；3.安徽省兴诚生态农业发展有限公司，安徽 安庆246200）

香樟（Cinnamomum caphora），樟科樟属，树形雄伟壮观，主干高大挺拔，四季常绿，冠大浓荫，枝叶秀丽而有香气，是我国南方城市非常优美优良的行道树，也是风景园林中形成植物造园景观常见的树种之一[1]。香樟是具有较强耐水淹特性的优良树种，发展潜力巨大。目前国内外对香樟组培研究取得了一定的成果。国内一些学者分别利用香樟伐根萌条[2-3]、不同龄期的茎段[4-12]、茎尖[13]、种子[14]、离体胚[15]、幼叶[16]、嫩芽[17-20]等作为外植体进行组织培养研究工作并诱导出完整植株；K.Nirmal Babu 等[21]也报道香樟茎段组织培养技术的研究成果。目前虽然有不少香樟组织培养获得成功的报道，但不同学者间观点还存在一定分歧，对香樟的组培体系的建立，成年香樟组培再生体系中增殖环节出现落叶、生根率不高等问题，尚需加强其高效组培再生体系建立的研究。为进一步规模化生产提供技术支持，本试验以香樟萌发的茎段为外植体材料，对组织培养技术进行研究[6，8]，以期通过组织培养，在保持母本优良性状的同时促进香樟快速繁殖，实现工厂化生产，满足市场需求[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

选择安徽省望江县兴诚生态农业发展有限公司林业基地中具有较强耐水淹能力的优良香樟种子为试验材料，将所获种子消毒萌发形成无菌苗，取其幼嫩带腋芽茎段作为组织培养外植体材料。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒

选取颗粒饱满的种子，将其浸泡到无菌水中4 h 后，在超净工作台上利用75%酒精迅速漂洗15 s，重复3 次，再用1%次氯酸钠浸泡5 min，接着用无菌水冲洗5 次，最后用无菌吸水纸将种子上的水分吸干备用。

将处理过的种子放至MS 培养基中，每瓶1 粒种子，3 周后观察，共接50 瓶，重复3 次试验。统计种子发芽率及污染率。

试验选取0.5%次氯酸钠、1%次氯酸钠为消毒剂，每种消毒剂分别处理3 min、5 min、7 min，即一共6 个处理组合。

A：0.5%次氯酸钠处理3 min；B：0.5%次氯酸钠处理5 min；C：0.5%次氯酸钠处理7 min；D：1%次氯酸钠处理3 min；E：1%次氯酸钠处理5 min；F：1%次氯酸钠处理7 min。

3 周后统计不同消毒处理后种子污染率及发芽率。

种子污染率(%)=(污染种子数/接种种子总数)×100%

种子发芽率(%)=(发芽的种子数/接种的种子总数)×100%

1.2.2 培养条件

试验培养温度(25±1)℃，光照时间14～16 h/d，光照强度1 500 ～2 000 lx。

1.2.3 芽的诱导

无菌条件下将生长30 d 左右的香樟无菌苗幼嫩茎段作为外植体，切成0.55 cm长，再转接到添加有6-BA0.5、1、1.5 mg/L 和NAA0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L组合的诱导培养基中，经过10～20 d 培养观察出芽情况。

1.2.4 芽的增殖

将新芽分割成单株接种到添加有6-BA 1、2、3、4 mg/L 和NAA 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 组合的增殖培养基中继代培养，观察增殖情况。

当培养基选定为MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 时，分别添加浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L 的活性炭，接种新芽分割的单株芽，观察不同浓度活性炭对芽苗褐化率和增殖的影响。

1.2.5 芽的生根

当芽苗长至3 cm 高时接种到添加IBA 0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L 和NAA 0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L 的1/2MS培养基中，观察芽苗的生根情况。

当培养基选定为1/2MS+0.5 mg/LIBA+0.3 mg/L NAA 时，分别添加浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L 的活性炭，接种3 cm 高的芽苗进行培养，观察不同浓度活性炭对芽苗褐化和生根率的影响。

2 结果与分析

2.1 不同消毒组合对种子污染及发芽率的影响

接种7 d 后可见种子萌芽，培养30 d 后无菌芽伸长，芽体叶片呈绿色。由表1 可以看出，消毒效果最好的是E 处理，污染率为0。由表2，可以看出E处理对种子发芽率的影响最小，发芽率为95%。综合种子污染率以及种子发芽率结果，最佳的消毒处理方式为E，即1%次氯酸钠处理5 min。

表1 不同消毒组合处理后对香樟种子污染率的影响

表2 不同消毒组合处理后对香樟种子发芽率的影响

2.2 不同激素配比对芽诱导的影响

取香樟无菌苗上幼嫩的带腋芽茎段接入不同组合的培养基内，经过10～20 d 培养，观察出芽情况。添加不同细胞分裂素6-BA 与生长素NAA 激素配比对无菌外植体启动诱导。由表3 可知，培养基中随着添加6-BA 的量增加，诱导率也随之增加，但到1.5 mg/L 时，有部分茎芽出现半透明状，说明6-BA mg/L的量偏高，不利于腋芽的诱导启动和培养。当6-BA的量为1 mg/L、添加NAA 的量到0.1 mg/L 时诱导率达到最高。因此激素组合为MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA 时芽苗诱导率最高为81%。

表3 不同激素配比对芽的诱导的影响

2.3 不同激素配比对芽增殖的影响

随着6-BA 量的增加，不定芽团增殖倍数随之增加，但添加超过3 mg/L 后，有部分茎芽出现弯曲、基部膨大、叶片半透明状等现象，说明6-BA 的量超过3 mg/L 后属于分裂素偏高，不利于不定芽的增殖和培养，可供生根的苗很少。当6-BA 的浓度不变，添加NAA 的量达到0.5 mg/L 时增殖效果最好。因此激素组合MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 时增殖效果最好，增殖系数为6.7。

但是从试验结果可以看出，在继代培养过程中，褐化率比较高，芽苗褐化死亡，严重影响再生效率。于是在表4 增殖系数最高的激素组合基础上添加活性炭进行试验，观察不同浓度活性炭对褐化率和增殖系数的影响。由表5 可知，当活性炭浓度为2 g/L 时，增殖系数为6.9 相较于之前的6.7 有所提高。同时褐化率最低为3.1%，相比于不添加活性炭时，褐化率降低了23.1%，大大提高了组培苗的再生效率。

表4 不同激素配比对芽的增殖的影响

表5 不同浓度活性炭对褐化率和增殖的影响

2.4 不同激素配比对苗生根的影响

由表6 可知，生根率最高为93%，生根率最低为71%。激素组合为1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA 时生根效果最好，生根率为93%，且生根较粗，均匀。

但是从试验结果可以看出，在生根过程中，褐化率比较高，芽苗褐化不生根甚至死亡，严重影响再生效率。于是在表6 生根率最高的激素组合基础上添加活性炭进行试验，观察不同浓度活性炭对褐化率和生根率的影响。由表7 可知，当活性炭浓度为2 g/L 时，生根率为98%，相较于之前的93%有所提高，同时褐化率最低为3.4%。相比于不添加活性炭时，褐化率降低了21.6%，大大提高了组培苗的再生效率。

表6 不同激素配比对苗生根的影响

2.5 试管苗的炼苗与移栽

将试管苗在无菌组培室进行初期炼苗时发现，水分缺失非常快。所以逐步在开盖的组培瓶中加入无菌水，以保持试管苗正常生长所需的水分。将试管苗取出培养基时，尽量减少对根部的伤害，用流水将其基部残留的培养基全部冲洗干净，再转移至培养基质中。前期生长较缓慢，移植时根系较发达的香樟试管苗生长旺盛。

表7 不同浓度活性炭对褐化率和生根率的影响

3 结论与讨论

目前国内外不少关于香樟的组织培养的研究工作并取得成功，多数研究者在香樟组培过程中选用的基本培养基为MS、改良MS、1/2 MS 并按照不同的培养阶段进行相应的调整，在腋芽诱导所使用的植物生长调节剂以及浓度范围为6-BA（1~2 mg/L）和NAA（0.05~0.5 mg/L）；增殖阶段为6-BA（3~5 mg/L）和IBA（0.2~0.1 mg/L），不同学者对于最佳浓度组合的观点存在一定的分歧。这可能与外植体采集的品种、时间、树龄等诸多因素有关。本试验中使用的基本培养基与其他研究者基本一致，但使用的植物生长调节剂种类和浓度有些许差异。在腋芽诱导过程中最适激素组合为MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。而在增殖过程中所选用的激素为6-BA和NAA 组合，相比之下6-BA 与IBA 组合容易导致芽苗生长衰弱。

同时香樟在组织培养过程中，自身生长累积了各种代谢物质，常会出现不生根、褐化等现象，不同程度地影响到其正常生长[22]。本试验中加入适量浓度的活性炭，能够吸收各种代谢物质，很好地改善组培苗生长环境，使得组培苗的褐化率降低、生根率提高[23]，从而非常有效地提高香樟组织培养的再生效率，更大量高效获得耐水淹香樟组培苗，满足市场需求。